本发明专利技术公开了一种用于鉴定或辅助鉴定小麦春化基因VRN-A1的PCR体系及其应用。本发明专利技术的PCR体系中的引物对组由特异于VRN-A1基因的两个引物对组成；所述特异于VRN-A1基因的两个引物对分别为序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2。本发明专利技术所提供的引物对组中各引物对之间不存在相互抑制作用和错配，检测结果可靠、重复性好，成本低，且特异性强，检测过程耗时短；本发明专利技术对检测小麦品种的冬春性，进而提高育种的效率，加强对育种高代的选择具有重要意义；另外，本发明专利技术使得在小麦推广和引种过程中，有更强的目标性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于鉴定或辅助鉴定小麦春化基因VRN-Al的PCR体系及其应用， 特别涉及一种用于鉴定或辅助鉴定小麦春化基因VRN-Al的多重PCR引物对组、试剂盒及其应用。
技术介绍
春化阶段是小麦生长发育的基本阶段之一。小麦的春化反应与其生育期及适应性密切相关，是指导小麦区划和新品种推广的主要依据之一，受春化基因控制。春化基因决定小麦全生育周期长短的7(T75%。Iwaki和Van Beem等研究表明，世界不同地区小麦品种的春化基因组成存在差异，反映了不同生态类型对品种春化反应的要求不同。春化基因VRN-I编码的蛋白为MADS-box转录因子，受低温诱导促进开花，是普通小麦春化作用的一类主要基因，包括3个位点VRN-A1、VRN-Bl和VRN-D1，分别位于5A、5B 和5D染色体长臂上。3个基因位点不同的等位变异对春化作用的效应不同，显性等位变异 Vm-Al的效应最强，表现为对春化作用高度不敏感，同时对Vrn-Bl和Vrn-Dl位点基因具有上位性效应；显性等位变异Vrn-Bl和Vrn-Dl对春化作用的敏感性较弱，两者之间未发现彼此间的上位作用。Yan和Fu等发现，VRN-I春化基因变异类型受其启动子区和第一个内含子区决定。在普通小麦中，VRN-Al位点有4种变异类型，分别为Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和 vrn-Al，其中 Vrn-Ala、Vrn-Alb 和 Vrn-Alc 表现为显性，vrn-Al 为隐性；VRN_B1 和 VRN-Dl 位点一般通常存在两种等位变异类型，即显性和隐性等位变异。与隐性等位变异类型相比， 显性等位变异Vrn-Ala和Vrn-Alb分别在启动子区域插入和缺失了一定数量的碱基序列， 而显性Vrn-Alc、Vrn-Bl和Vrn-Dl在第一个内含子序列出现了大片段碱基的缺失。在普通小麦中，VRN-Al位点存在4种等位变异，需要用3对引物分别进行3次PCR 检测；VRN-B1和VRN-Dl位点两种等位变异，需要用两对引物分别进行两次PCR检测。为此， 检测I个小麦材料春化基因VRN-I的3个位点等位变异组成，需要连续进行7次PCR检测， 检测程序繁琐，实验成本高。多重PCR这一概念自1988年由Chambercian等提出后，由于其快速、高效、低成本等一系列的优点，使得这项技术在生命科学领域得到了广泛的应用，如植物种质纯度鉴定、 植物分子育种、植物病虫害检测等。利用多重PCR技术，在同一个PCR反应体系中加入两对或两对以上特异性引物进行扩增，可以同时检测出多个等位变异类型，降低检测成本，提高效益。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于鉴定或辅助鉴定待测小麦春化基因的多重PCR引物对组、试剂盒，以及利用所述多重PCR引物对组鉴定或辅助鉴定待测小麦春化基因的方法。本专利技术所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测小麦春化基因的多重PCR引物对组，由特异于所述VRN-Al基因的两个引物对组成；所述特异于VRN-Al基因的两个引物对分别为序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2。其中，序列I由20个核苷 酸组成；序列2由20个核苷酸组成；序列3由20个核苷酸组成；序列4由20个核苷酸组成。本专利技术中，所述VRN-Al基因有四个等位基因，分别是Vrn-Ala、Vrn-Alb, Vrn-Alc 和vrn-Al (前三个表现为显性,最后一个表现为隐性)。所述引物对组中，所述序列I、所述序列2、所述序列3和所述序列4共四条单链 DNA在PCR反应体系中的摩尔比为I I. 5 Γ . 5 Γ . 5 Γ .。在本专利技术的一个实施例中，所述引物对组中，所述序列I、所述序列2、所述序列3 和所述序列4共四条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔比为I :1 :1 :1。含有所述引物对组的试剂盒也属于本专利技术的保护范围。所述引物对组的制备方法也属于本专利技术的保护范围。该引物对组的制备方法可包括将所述引物对组中各序列所示单链DNA分别单独包装的步骤。所述试剂盒的制备方法也属于本专利技术的保护范围。该试剂盒的制备方法可包括如下步骤将所述引物对组中各序列所示单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn-Al这四种基因中哪一种的方法也属于本专利技术的保护范围。该方法具体可包括如下(I)和(2)步骤(I)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述引物对组中的所述引物对组A进行 PCR反应，所述PCR反应的退火温度为60°C ；(2)检测步骤(I)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测小麦含有Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn-Al这四种基因中哪一种若所述PCR产物中同时含有715bp和624bp的两个DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有Vrn-Ala基因；若所述PCR产物中含有473bp的DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有Vrn-Alb基因；若所述PCR产物中含有493bp的DNA片段、同时不含有1068bp 的DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有Vrn-Alc基因；若所述PCR产物中同时含有 493bp和1068bp的两个DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有vrn-Al基因。本专利技术的再一个目的是提供一种培育春性小麦品种的方法。所述春性小麦品种通过春化阶段时对温度要求范围较宽，经历时间也较短。一般在秋播地区要求O 12°C，北方春播地区要求在O 20°C，经过15天的时间可以通过春化阶段。培育春性小麦品种的方法具体可包括采用含有Vrn-Ala基因、Vrn-Alb基因和Vrn-Alc基因中至少一种的小麦作为亲本进行育种的步骤。从众多小麦品种中选择满足上述条件的小麦的方法，即为上述鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn-Al这四种基因中哪一种的方法。本专利技术根据春化基因VRN-Al的STS标记，基于目标基因组成已知材料的验证结果，分别建立检测春化基因位点VRN-Al等位变异的多重PCR体系，以期为春化基因VRN-Al的快速检测提供更加简便、准确的方法。本专利技术所提供的PCR引物对组中各引物对之间不存在相互抑制作用和错配，检测品种的结果可靠、重复性好，成本低。本专利技术所提供的PCR 引物对组中的各引物对均选用同样的退火温度，实现了相同温度一次PCR完成一组基因的鉴别，且特异性强，检测过程耗时短。本专利技术对检测小麦品种的冬春性，进而提高育种的效率，加强对育种高代的选择具有重要意义；另外，本专利技术使得在小麦推广和引种过程中，有更强的目标性。附图说明图I为12个小麦品种春化基因VRN-I的位点VRN-Al的多重PCR扩增图谱。其中， 泳道M为标准分子量DL2000 ;泳道I为新春16 ;泳道2为龙辐麦I号；泳道3为中国春；泳道4为北京10号；泳道5为甘麦8号；泳道6为大白皮；泳道7为龙辐麦3号；泳道8为辽春10号；泳道9为龙麦20 ;泳道10为皖麦33 ;泳道11为宁春37 ;泳道12为德麦3号。具体实施方式下述实施例中所本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于鉴定或辅助鉴定待测小麦春化基因的多重PCR引物对组，所述小麦春化基因为VRN？A1基因，其特征在于：所述多重PCR引物对组由特异于所述VRN？A1基因的两个引物对组成；所述特异于VRN？A1基因的两个引物对分别为序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张晓科，穆培源，相吉山，张影全，桑伟，王晓龙，徐红军，王轩，韩新年，聂迎彬，崔凤娟，邹波，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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