单个B细胞培养方法技术

本文报导了得到B细胞的方法，其包括以下步骤：a)标记B细胞，b)将标记的B细胞沉积为单细胞，c)和饲养细胞共培养单细胞沉积的B细胞，d)选择步骤c)中增殖和分泌IgG的B细胞并从而得到B细胞。标记可以是IgG+CD19+-B细胞、IgG+CD38+-B细胞、IgG+CD268+-B细胞、IgG-CD138+-B细胞、CD27+CD138+-B细胞或CD3-CD27+-B细胞。所述方法可包括在沉积步骤以前，在EL-4B5培养基中在37℃孵育1小时所述B细胞的步骤。所述方法还可包括在共培养以前离心所述单细胞沉积的B细胞的步骤。在共培养中，可使用包含白介素-1β和肿瘤坏死因子α和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)Cowans菌株细胞或BAFF或白介素-2和/或白介素-10和/或白介素-6和/或白介素-4的饲养混合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单个B细胞培养方法本文报导了得到由单个B细胞分泌的单克隆抗体的至少可变结构域的氨基酸序列的方法，所述单个B细胞是通过单细胞沉积和在饲养混合物存在下与饲养细胞共培养从来自实验动物的B细胞群中得到的。
技术介绍
为了得到分泌单克隆抗体的细胞,广泛使用Koehler和Milstein开发的杂交瘤技术。但是在杂交瘤技术中，只能融合和增殖从经免疫的实验动物中得到的B细胞的一部分。B细胞的来源通常是经免疫的实验动物的器官，例如脾。Zubler等人从1984年开始开发不同的方法用于得到分泌单克隆抗体的细胞(见例如 Eur. J. Immunol. 14(1984)357-63，J. Exp. Med. 160(1984) 1170-1183)。其中从经免疫的实验动物的血液中得到B细胞，并在包含细胞因子的饲养混合物的存在下与鼠EL-4B5饲养细胞共培养。使用此方法，在共培养10-12天后可得到多达50ng/ml的抗体。ffeitkamp, J-H.，等人，(J. Immunol. Meth. 275(2003)223-237)报导了从用荧光病毒样颗粒选择的单个抗原特异性B细胞中生成针对轮状病毒的重组人单克隆抗体。在US2006/0051348中报导了生产针对多种同源抗原的多种分离的抗体的方法。在W02008/144763和W02008/045140中分别报导了针对IL-6的抗体及其用途，以及得到抗原特异性B细胞的克隆群的培养方法。在US2007/0269868中报导了得到抗原特异性B细胞的克隆群的培养方法。Masri等人(在Mol. Immunol. 44 (2007) 2101-2106中)报导了在大肠杆菌(E. coli)中克隆和表达功能性Fab片段，所述片段从针对炭疽毒素的单个人淋巴细胞中得到。在W02007/031550中报导了制备免疫球蛋白文库的方法。专利技术概沭本文报导了从具有特殊性质的B细胞群中分离B细胞的方法。首先，在实验动物第一次免疫后4周内已经可以分离诱导的抗体生产细胞，并可测定抗体的结合特异性。其次，可通过以下任一步骤提高抗体生产细胞的数量和/或质量(例如抗体生产/分泌能力)i)预孵育步骤，和/或ii)离心步骤，和/或iii)淘选步骤。第三，可通过加入IL-21，或IL-6，或SAC，或BAFF改善用于B细胞和饲养细胞共培养的饲养混合物。因此，在一个方面本文报导了选择B细胞的方法，所述方法包括以下步骤a)任选地标记B细胞群的B细胞，b)单独地共培养已沉积为单细胞的B细胞群的每个B细胞和饲养细胞，c)选择在步骤b)中增殖并分泌抗体的B细胞。在一个方面，本文还报导了得到B细胞克隆的方法，所述方法包括以下步骤a)从实验动物中得到B细胞，b)标记B细胞，c)将标记的B细胞沉积为单细胞，d)单独地共培养单细胞沉积的B细胞和饲养细胞，e)选择在步骤d)中增殖并分泌抗体的B细胞并因此得到B细胞克隆。在另一个方面，本文报导了生产特异性结合靶抗原的抗体的方法，所述方法包括以下步骤a)任选地用至少一种荧光染料标记B细胞群的细胞，b)在饲养细胞和饲养混合物的存在下培养已在单独的容器中沉积为单细胞的B细胞群的每个B细胞，以得到单独的B细胞克隆和培养物上清液，c)选择生产特异性结合靶抗原的抗体的B细胞克隆，d)培养含有编码特异性结合靶抗原的抗体的核酸的细胞，所述抗体由步骤c)中选择的B细胞克隆生产，或为其人源化变体，并从细胞或培养物上清液中回收抗体，从而生产抗体。在一个实施方案中，所述方法包括一个或多个以下步骤在步骤c)后cl)通过逆转录酶PCR测定编码抗体的可变轻链结构域和可变重链 结构域的核酸序列，在步骤Cl)后c2)用包含编码抗体可变轻链结构域和可变重链结构域的核酸序列的核酸转染细胞。在一个方面，本文还报导了生产抗体的方法，所述方法包括以下步骤a)提供(成熟的)B细胞群(从实验动物的血液中得到)，b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用I至3种，或2至3种荧光染料)标记B细胞群的细胞，c)在单独的容器中沉积经标记的B细胞群的单个细胞(在一个实施方案中，容器是多孔板的孔)，d)在饲养细胞和饲养混合物的存在下培养沉积的各个B细胞(在一个实施方案中，饲养细胞是EL-4B5细胞，在一个实施方案中，饲养混合物是天然TSN，在一个实施方案中，饲养混合物是合成的饲养混合物)，e)测定在各个B细胞的培养基中分泌的抗体的结合特异性，f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序来测定特异性结合抗体的可变轻和重链结构域的氨基酸序列，并从而得到单克隆抗体可变轻和重链结构域的编码核酸，g)为了表达抗体，将单克隆抗体可变轻和重链可变结构域编码核酸引入表达盒，h)将核酸引入细胞，i)培养细胞并从细胞或细胞培养物上清液中回收抗体，并从而生产抗体。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述方法包括在单细胞沉积以前，在共培养培养基中孵育B细胞群的步骤。在一个实施方案中，在约37° C进行孵育。在一个实施方案中，孵育进行O. 5至2小时。在特定的实施方案中，孵育进行约I小时。在一个实施方案中，在约37° C进行孵育约I小时。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述方法包括在共培养以前离心单细胞沉积的B细胞的步骤。在一个实施方案中，离心进行约I分钟至约30分钟。在特定的实施方案中，离心进行约5分钟。在一个实施方案中，以约IOOx g至约1，OOOx g进行离心。在特定的实施方案中，以约300x g进行离心。在一个实施方案中，以约300x g离心约5分钟。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述方法包括紧接标记步骤以前的以下步骤用固定的抗原淘选B细胞。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，通过密度梯度离心从动物血液中得到B细胞群。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，在免疫后4天从实验动物血液中得到B细胞群。在另一个实施方案中，从在免疫后从4天到至少9天的实验动物血液中得到B细胞群。在进一步的实施方案中，从在免疫后从4天到9天的实验动物血液中得到B细胞群。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，通过密度梯度离心分离B细胞群。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞是成熟的B细胞。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，用I至3种荧光染料进行标记。在特定的实施方案中，用2至3种荧光染料进行标记。 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞的标记导致总B细胞群的O. 1%至2. 5%的细胞的标记。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞是小鼠B细胞，或仓鼠B细胞，或兔B细胞。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，在多孔板的孔中进行单细胞沉积。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，饲养细胞是鼠EL-4B5细胞。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，标记是IgG+CD19+-B细胞，IgG+⑶38+-B细胞，IgG+CD268+-B 细胞，IgGTD138+_B 细胞，CD27+CD138+-B 细胞，或 CD3-CD27+-B 细胞。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述B细胞是小鼠来源的，且标记是IgG+CD19+-B 细胞，和 / 或 IgGTD138+-B 细胞。在本文报导的所有方面本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·恩德尔，N·舒马赫尔，S·奥夫纳，J·普拉策尔，B·西韦，I·托雷，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：
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