本发明专利技术公开了一种制备高活性低毒副作用肝素的方法。本发明专利技术制备高活性低毒副作用肝素的方法，是以肝素为底物，采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)再生系统，以肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶、2-O-脱硫酸基酶对其进行选择性修饰，得到高抗凝活性低毒副作用肝素。本发明专利技术方法所采用的3-O-硫酸基转移酶、2-O-脱硫酸基酶可通过发酵制备；所述PAPS再生系统，以PNPS(对硝基苯酚磺酸钾盐)作为酶修饰反应的硫酸基供体，极大地降低了生产成本，使工业化成为可能。本发明专利技术为工业化制备高活性低毒副作用肝素提供了新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。属生物医药领域。
技术介绍
肝素是有己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以I — 4糖苷键交替形成的粘多糖，其分子量在3000-40000Da之间，平 均分子量为15000Da ；肝素作为抗凝试剂和抗栓试剂已有60多年的历史。肝素的抗凝血活性主要通过含有3-位硫酸基氨基葡萄糖的戊糖活性中心结合抗凝血酶(AT-III)，诱导其发生构象改变，从而显示抗凝血活性。肝素的抗凝血活性包括抗栓活性(anti-factor Xa)和抗凝活性(anti-factor IIa)。但是由于肝素具有抗凝血活性，所以大量的使用会引起出血和诱导性血小板减少、骨质疏松等副作用，从而大大的限制了肝素在临床上的应用。此外，肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等方面的生活功能。现有研究表明，肝素的抗凝血活性取决于其戊糖活性中心的数量。戊糖结构中N-, 6-0-及3-0-位硫酸基参与结合AT-III，与抗凝血活性有关，而艾杜糖醛酸的作用尚不清楚。其中3-0-位硫酸基尤为重要如果缺少3-0-位硫酸基，肝素的抗凝血活性则会降低1000倍以上；相反，增加一个3-0-位硫酸基，则可以将肝素的抗凝血活性提高数倍。肝素由多4种生物合成酶在线粒体内合成。合成过程中会涉及多种合成酶，如2-0-，6-0_，3-0-硫酸基转移酶(2-0ST，6-0ST, 3-0ST)分别对主链不同位置上的羟基进行部分硫酸化，其中3-0-位硫酸化由3-0ST完成。这些硫酸基转移酶大多具有多种异构型式，如3-0ST就具有六种异构体。其中，3-0ST-1和3-0ST-5能合成肝素戊糖活性中。现有研究表明肝素及低分子量肝素都是3-0ST-1和3-0ST-5很好的底物。因此，用3-0ST-1和3-0ST-5对低分子量肝素选择性修饰，使80%不具有戊糖活性中心的低分子量肝素经过反映后拥有戊糖活性中心，就可以大幅度提高低分子量肝素的戊糖活性中心的数量，从而提高其抗凝血活性(理论上可以同时提高抗栓和抗凝活性3-5倍)。此外研究还表明，2-0硫酸基对肝素发挥抗凝活性是非必须的。与普通肝素相比，2-0-位硫酸基的缺失降低电荷密度降低减少非特异性蛋白吸附，可一定程度降低出血风险、减少血小板聚集等。2-0-位脱硫酸化可以由2-0-sulfatase完成,2-0_sulfatase对肝素及低分子量肝素又很好的底物特异性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备高抗凝血活性低毒副作用肝素的方法本专利技术所提供的制备高抗凝血活性低分子量肝素的方法，是以肝素为底物，采用PAPS (3’ -磷酸腺苷-5’ -磷酸硫酸)再生系统，以肝素生物合成酶3-0-硫酸基转移酶、2-0-sulfatase对其进行选择性修饰，增加抗凝活性中心的数量、降低电荷密度，得到高抗凝活性低毒副作用肝素。本专利技术方法所采用的3-0-硫酸基转移酶、2-0-sulfatase均可通过发酵制备；所述PAPS再生系统，以PNPS (对硝基苯酚磺酸钾盐)作为酶修饰反应的硫酸基供体，极大地降低了生产成本，使工业化成为可能。本专利技术为高活性低毒副作用肝素的酶法工业化生产提供了新的途径。所述肝素是市售的未分级肝素。所述PAPS 再生系统中，反应液为含 I % Triton X-100,1% BSA7ImM MgCI2, ImMMnCI2, pH 为 5. 0-8. O 的 50mM Tris-HCI 缓冲液。所述PAPS再生系统中，PNPS的浓度为O. I-IOmM, PAP的浓度为O. l_50uM。所述方法中，AST-IV的用量为 O. l-50mg/ml ;优选 5-lOmg/ml。所述方法中，肝素生物合成酶3-0-硫酸基转移酶的用量为O. l-50mg/mg底物；优选 l_20mg/ml 底物。所述方法中，按照以下方法纯化低分子量肝素终止反应后，离心分离得到上清 液，将此上清液与两倍提及的缓冲液A混合，对DEAE柱上样；一词以缓冲液A和缓冲液B进行梯度洗脱，收集第二次洗脱所得洗脱液，得到高活性低分子量肝素；所述DEAE分离所用的缓冲液A为喊质量百分含量为O. 5-2. 5%的NaCI水溶液，缓冲液B为含质量百分含量为2. 5-5. 0%的 NaCI 水溶液。本专利技术的方法采用具有高效酶活性的肝素生物合成酶3-0-硫酸基转移酶、2-0-sulfatase制备高抗凝血活性低毒副作用肝素。重组的AST_IV、3-0ST_1及2-0-sulfatase均可通过发酵获得，且均携带6个组氨酸标签，一步纯化就可得到90%以上的蛋白酶。利用AST-IV对PNPS以及PAP的双底物进行硫酸基酶促反应，实现了 PNPS的再生系统，从而可以使用极为廉价的PNPS作为硫酸基供体，降低了高抗凝血活性低分子量肝素的成本。本专利技术通过用高活性3-0ST-l、2-0-sulfatase对肝素进行选择性修饰，得到了高抗凝血活性低毒副作用的肝素(抗凝血活性比现有低分子量肝素提高3-5倍)，具有巨大的工业应用价值。具体实施例方式下述实施例将具体说明本专利技术的操作方法，但不能作为对本专利技术的限定。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例I、肝素的3-0-位的硫酸化修饰PAPS再生系统组分浓度为PNPS的浓度为5mM，PAP的浓度为20uM ；PAPS再生系统中AST-IV的用量为10mg/mM PAPS。按以上组成所制备的溶液加入制备高活性低分子量肝素的溶液，作为肝素生物合成酶3-0-硫酸基转移酶修饰反应的硫酸基供体。以肝素为原料，反映条件为Img肝素溶解在20ml反应液中于室温震荡(300)反应 6h。反应液包含 50mM 的 Tris-HCI (pH 7. 2), 1% Triton X-100,1 % BSA, ImM MgCI2, ImMMnCI2, ImM PNPS,40uM PAP，8mg3-0ST_l 及 4mgAST_IV。100°C下加热反应 15 分钟终止反应，分离得到上清液，100°C下加热反应液15分钟终止反应，12000rpm高速离心，真空冷冻干燥得冻干粉。实施例2、肝素的2-0-位的脱硫酸化修饰以3-0-位硫酸化修饰的肝素为原料，反映条件为IOmg未分级肝素溶解在Iml的反应液中，30°C震荡(300)反应。反应液包含2-0-脱硫酸基酶3IU/g肝素，10mg/ml的肝素，50mM NaCl, 50mM咪唑pH6. 5。将上清液雨量被提及的2. 0%的NaCI水溶液混合，对DEAE柱上样；一次以2. 0%的NaCI水溶液和3. 0%的NaCI水溶液进行梯度洗脱，收集第二次洗脱所得洗脱液，得到高活性低分子量肝素。所得溶液用去离子水透析24小时，冻干得高活性肝素冻干粉。实施例3、高活性低毒副作用肝素的抗凝血活性研究用lmg/mL BSA的磷酸缓冲液(PBS)，将凝血因子Xa稀释至lU/mL，用lmg/mL BSA的PBS溶解抗凝血酶AT得到浓度为27mM的储液，以PBS稀释溶解凝血酶发色底物S-2765，终浓度为 1禮。用 50rnMTris’ HCl (pH 8. 4)，7. 5mM 的 Na2EDTA 和 175mM NaCl 的 缓冲本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备高抗凝活性低毒副作用肝素的方法，是以肝素为底物，采用3’？磷酸腺苷？5’？磷酸硫酸(PAPS)再生系统，以肝素生物合成酶3？O？硫酸基转移酶对其进行选择性修饰，再以2？O？脱硫酸基酶对2？O？位硫酸基脱硫酸化，增加抗凝活性中心的数量并降低其电荷密度，得到高抗凝活性低毒副作用肝素。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈敬华，刘卫超，周斌，王敏，程咏梅，滕丽萍，陈荆晓，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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