本发明专利技术公开一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，是以枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）GXA-28，保藏编号为CCTCCNO：M2012347的菌株通过菌种活化、保藏、种子液制备、液体摇瓶发酵、γ-聚谷氨酸提取纯化制备γ-聚谷氨酸。本发明专利技术可广泛使用廉价的碳氮源，例如糖蜜、无机铵盐，其中可将无机铵盐作为唯一氮源使用，在40~50℃的高温发酵条件下高效生产γ-聚谷氨酸，发酵时间18~25h，产量最高可达20~30g/l，生产速率可达0.9~1.3g/l?h，具有高效、低成本的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵领域，特别涉及到一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产Y-聚谷氨酸的方法。
技术介绍
Y -聚谷氨酸(Poly ( Y -glutamic acid)，Y -PGA)是由 L-谷氨酸和 D-谷氨酸通过Ct-氨基和Y -羧基聚合而成的一种独特的生物高分子。1937年由Ivdinovics等人首先在炭疽芽胞杆菌荚膜中发现(Iv0novics and Bruckner 1937; Ivanovics andErd5sl937);并在1942年被证实可作为发酵产物由枯草芽孢杆菌分泌至液体培养基中(BoVamickl942)。由此，枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌被作为主要的Y-聚谷氨酸产生菌引起了广泛的研究。y -聚谷氨酸通常是由500-5000个谷氨酸单体聚合而成，分子量在IOO-IOOOkDa 之间。Y -聚谷氨酸分子中的谷氨酸残基上带有大量游离的亲水性羧基，可在分子内部或分子间形成氢键，具有极高的水溶性和吸水保湿性；这些游离羧基同时提供了阳离子结合的基团，使其对金属离子具有良好的吸附性。除此之外，Y-聚谷氨酸作为一种环境友好型生物高分子，还具有一些独特的优良特性，如可食用、可降解、生物兼容性、对人体和环境无毒害等。因此，其被作为冷冻保护剂、祛苦剂、增稠剂和矿物质吸附剂应用于食品领域；作为药物输送剂、基因载体、医用生物粘合剂应用于医药领域；作为热塑性材料、水凝胶等应用于工业和农业领域；作为金属吸附剂和生物絮凝剂应用于环保领域；作为保湿剂应用于化妆品领域。Y -聚谷氨酸制备方法主要有化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。化学合成法过程复杂、收率低，工业应用价值不大；酶转化法，由于酶促反应所需的谷氨酰转肽酶在生物体内含量和活力较低，且分离纯化困难，因此制约了酶转化法的发展和应用。微生物合成法由于发酵过程容易控制、产量稳定、提取工艺简单、提取率高以及便于大规模生产等优点，已逐渐成为Y-聚谷氨酸的主要生产方法。尤其是近十年来，国内外对微生物发酵生产Y-聚谷氨酸进行了广泛深入地研究。目前，日本和韩国已进行了工业化试生产。国内开展Y-聚谷氨酸的研究相对较晚，一些科研院校主要对Y -聚谷氨酸产生菌筛选、发酵工艺优化、分批发酵生产等进行了研究，取得了一些可喜的研究成果。Y-聚谷氨酸经过近二十年的研究和发展，菌种的发酵生产能力得到了较大幅度的提高，关于Y-聚谷氨酸的生产工艺研究，我们查到以下公开文献I.申请号01127287. 2，专利技术名称Y-聚谷氨酸及其盐的制备方法，通过采用芽孢杆菌属菌株，如枯草芽孢杆菌，地衣芽胞杆菌，在37°C，含碳源、氮源、谷氨酸培养基上培养，生成高活力的Y-谷氨酰转肽酶，酶活力为l-10U/ml，从而可生成高浓度的Y-聚谷氨酸发酵液，进而用溶剂沉淀或化学沉淀法得Y -聚谷氨酸或其盐。2.申请号02151746. 0，专利技术名称利用枯草芽孢杆菌NX-2制备Y-聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体，是将枯草芽孢杆菌NX-2在3(T37°C，含谷氨酸的培养基中培养，在优化条件下能积累3(T50g/l Y -聚谷氨酸，生产效率高达O. 8^2. 5g · IT1 · Γ1。3.申请号200410010509. 0，专利技术名称枯草芽孢杆菌及其用于制备Y-聚谷氨酸的方法，是将CGMCC No. 1250，在2(T40°C，含有碳源、氮源、谷氨酸、MgS04、NaCl和K2HPO4的培养基中培养，得到发酵液，再将发酵液通过有机溶剂沉淀、透析，得到Y-聚谷氨酸产品。该方法工艺简单，高效价廉，产量高。4.申请号200710130248. X，专利技术名称一株Y -聚谷氨酸的菌株及其培养方法，是将CGMCC No. 2108，在37°C，含有葡萄糖、酵母膏、谷氨酸钠、MgSO4和K2HPO4的培养基中培养，得到发酵液\。该方法简便易行，所用培养基的原料来源广泛，价格低廉，有效降低了生产成本,适合大规模的工业化生产。5.申请号200810027184. 5，专利技术名称一种Y-聚谷氨酸的制备方法，是用枯草芽孢杆菌(BaciIIus subtilis)PGA_7CCTCC M206102做发酵菌株对发酵培养基进行摇瓶发酵以制备Y-聚谷氨酸，其工艺过程包括斜面菌种活化、菌种的液体活化、摇瓶发酵和摇瓶发酵醪液提取，发酵温度为32 37°C。该专利技术采用由多种有机氮源和无机氮源相组合的优选的发酵原料，在最佳摇瓶发酵工艺条件下，产Y -聚谷氨酸最高可达27. 3g/l，具有良好的工业化应用前景。6.申请号200810150830. 7，专利技术名称枯草芽孢杆菌及用该菌株制备Y-聚谷氨酸的方法，是将编号为CCTCC NO M208044的菌株通过菌种培养保藏、制备种子液、摇瓶液体发酵以及提取Y-聚谷氨酸步骤制备Y-聚谷氨酸，其发酵温度为3(T40°C，发酵时间12 48小时。该方法可在低成本的液体培养基中高效合成Y-聚谷氨酸，且方法简单，可操作性强。7.申请号201010271196.X，专利技术名称一株Y-聚谷氨酸产生菌及利用其制备Y-聚谷氨酸及其盐的方法，是将编号为CGMCC No. 4034的菌株通过种子培养、发酵培养、Y-聚谷氨酸的提取步骤制备Y -聚谷氨酸，其发酵温度为3(T37°C，发酵时间2Γ72小时。该专利技术合成的Y-聚谷氨酸分子量较低(30(T400KDa)，分子量分布较窄，可适用于低分子量要求的应用领域。上述查到的专利，存在以下不足之处其发酵温度必须严格的控制在40°C以下、发酵条件要求高、发酵培养基成分复杂、发酵工艺成本高、发酵周期长、生产效率低等，严重制约了 Y-聚谷氨酸发酵工业化的进程。因此，寻找高效、低成本的发酵工艺条件生产Y-聚谷氨酸具有重要的生产意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产Y_聚谷氛酸的方法，本方法是以枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) GXA-28,保减编号CCTCC NO M 2012347为出发菌株，可广泛使用廉价的碳氮源，例如糖蜜、无机铵盐，其中可将无机铵盐作为唯一氮源使用，在4(T50°C的高温发酵条件下高效生产Y -聚谷氨酸，发酵时间18 25h，产量最高可达2(T30g/l，生产速率可达O. 9^1. 3g/l *h，具有高效、低成本的优点。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产Y-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤(I)菌种活化、保藏将枯草芽孢杆菌(BaciIIus subtilis)GXA_28接于固体斜面培养基上,40^50V培养8-16h，于2 8°C作短期保藏；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) GXA-28的保藏编号为CCTCC NO M 2012347，保藏日期为2012年9月14日，保藏单位中国典型培养物保藏中心；所述固体斜面培养基的浓度组成为葡萄糖8 12g/l，酵母膏T6g/l，谷氨酸钠:T6g/1，MgSO4 · 7Η200· Γθ. 2g/l，KH2PO4O. 3 0. 5g/l，琼脂 10 15g/l，pH 值 6· 5 7· 5，蒸馏水配制；(2)种子液制备将上述斜面上I. Ocm2的菌株接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中， 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ？聚谷氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）菌种活化、保藏将枯草芽孢杆菌（Bacillus？subtilis）GXA？28接于固体斜面培养基上，40~50℃培养8？16h，于2~8℃作短期保藏；所述枯草芽孢杆菌（Bacillus？subtilis）GXA？28的保藏编号为CCTCC？NO：M？2012347，保藏日期为2012年9月14日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；所述固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖8~12g/l，酵母膏3~6g/l，谷氨酸钠3~6g/l，MgSO4？7H2O？0.1~0.2g/l，KH2PO4？0.3~0.5g/l，琼脂10~15g/l，pH？值6.5？~？7.5，蒸馏水配制；（2）种子液制备将上述斜面上1.0cm2的菌株接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇床转速160？~？250rpm，40？~？50℃培养12？~？24h至菌株对数生长中期；所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖10？~？50g/l，酵母膏2~？10g/l，谷氨酸钠5？~？20g/l，MgSO4？7H2O？0.1？~？0.5g/l，KH2PO4？0.5？~？2g/l，pH？值6.5？~？7.5，蒸馏水配制；（3）液体摇瓶发酵将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中，接种量1~10%，摇瓶装液量20？~？80ml/250ml,？摇床转速160？~？250rpm，40？~？50℃培养18？~？25h；所述液体发酵培养基浓度组成为：碳源10？~？100g/l，氮源2~？20g/l，谷氨酸钠10？~？100g/l，MgSO4？7H2O？0.1？~？1g/l，KH2PO4？0.5？~？5g/l，pH？值6.5？~？7.5，蒸馏水配制；（4）γ？聚谷氨酸提取纯化收集成熟的发酵液，加入3？~？5倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.22？~？0.45μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为50？~？100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30？~？50%，加入2？~？4倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀，冷冻干燥得到γ？聚谷氨酸成品。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁智群，曾伟，陈桂光，张云开，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
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