本发明专利技术公开了一种红花檵木叶片总RNA的提取方法。采用本发明专利技术的提取方法提取的红花檵木RNA纯度高，杂质少，以α-tubulin、β-actin、18S?rRNA、GAPDH等几个常用的内参基因特异引物序列进行RT-PCR检测，能够得到比较亮的与引物设计的预期片段大小一致的特异条带（见图2）,即本试验所用的方法得到总RNA完整性好，能用于后续的RT-PCR扩增，进行相关基因的表达分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生 物
，具体涉及一种红花檣木叶片的RNA提取方法。
技术介绍
红花檣木(Loropetalum chinense var. rubrum)是长江中下游及以南地区具有丰富园林用途的主要彩叶植物之一，其叶片成色分子机理及叶色的遗传改良一直是相关研究者非常关注的问题，而从红花檣木中分离高质量的总RNA却是关键。红花檣木叶片生长过程中合成并积累大量的有鞣质、还原糖、苷类、黄酮类、酚类物质及有机酸，这些化合物会直接影响RNA的有效提取。现有的植物RNA提取中，主要采用传统的Trizol法。但是该方法提取的样品RNA降解比较明显，得不到完整的RNA，且还有其他杂质的存在，不能满足后续的PCR扩增试验的需要。目前已有多商品化的RNA抽提试剂经过小量调整可以适合几乎所有的动物组织，但却还没有一种商品化的RNA抽提试剂，可以适合大部分植物组织。另外，目前还没有红花檣木叶片总RNA提取的报道，红花檣木叶片成色的分子机理研究与应用也非常薄弱，限制了现代分子技术在其叶色遗传改良与种质创新中的应用。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种从红花檣木叶片中提取高质量总RNA的方法。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为一种红花檣木叶片总RNA的提取方法，包括如下步骤(I)准备新鲜红花檣木叶片；室外取材可以用以下两种处理①从健康红花檣木植株上选取10 15cm长的带有叶片的枝条快速插入装有1/3 1/4高度蒸懼水的烧杯中，并马上带回实验室；②从红花檣木枝条上选取健康叶片快速装入密封袋里，并快速将密封袋放入装满碎冰的泡沫盒，并马上带回实验室；(2)称取50 IOOmg步骤(I)所述的叶片，灭菌刀片切割成小片，放入灭过菌的I.5ml离心管，用液氮浸泡离心管内叶片8 IOs后，将叶片用小杵快速研磨成粉状；(3)向装有粉状叶片的离心管中加入O. 3 O. 5ml植物总RNA提取剂，平放离心管，室温静置3 5min,于4°C、12000rpm条件下离心I 2min,上清转至无RNase离心管；其中，所述的RNA提取剂购自天根生化科技有限公司RNA plantplus Reagent,产品编号DP437，添加β-巯基乙醇；(4)向装有上清的无RNase离心管中加入O. lml5M NaCl,温和混勻，再加入O. 3ml氯仿，上下颠倒混勻，于4°C、12000rpm条件下离心8 IOmin ；(5)取离心后的上层水相，转移至另一无RNase离心管，加入与所得水相等体积的异丙醇，混勻，室温静置8 IOmin,于4°C、12000rpm条件下离心8 IOmin ；(6)弃掉离心后的上清，但不要倒出沉淀物，加入Iml75%乙醇，于4°C，5000rpm条件下离心3 5min ；(7)倒出离心后的液体，但不要倒出沉淀物，剩余的少量液体再进行短暂离心，然后用枪头吸出液体，得离心沉淀物，即为RNA，室温晾干2 3min，加入50 μ IDEPC水溶解RNA ；(8)在步骤(7)所得的RNA溶液中加入buffer RDD、DNase储存液和RNase-freeddH20,于 20°C 25°C孵育 8 lOmin，再加入 20mM 的 EDTA，60°C 65°C孵育8 lOmin，之后置于_70°C保存备用；其中，所述的RNA溶液、buffer RDD、DNase储存液、RNase-free ddH20和20mM的EDTA五者的体积比为19 21:3 5:1:14 16:3 5，优选为 20:4:1:15:4。将本专利技术的方法与现有技术比较，所述现有技术为天根公司的植物总RNA提取试剂盒提取法(方法B)、天泽公司植物RNA提取试剂盒提取法(方法C)、传统的Trizol法(方法D)、用于侧柏的改良SDS法(方法E)和用于侧柏的CTAB法(方法F)，比较结果见表1，总RNA完整性检测对比见图I。表I本专利技术红花檣木叶片总RNA的提取方法与现有技术的效果比较权利要求1.一种红花檣木叶片总RNA的提取方法，包括如下步骤 (1)准备新鲜红花檣木叶片； (2)称取50 IOOmg步骤(I)所述的叶片，放入1.5ml离心管，用液氮浸泡离心管内叶片8 IOs后，将叶片快速研磨成粉状； (3)向装有粉状叶片的离心管中加入O.3 O. 5ml植物总RNA提取剂，静置3 5min，离心，上清转至无RNase离心管； (4)向装有上清的无RNase离心管中加入NaCl，混匀，再加入氯仿，混匀，离心； (5)取离心后的上层水相，转移至另一无RNase离心管，加入异丙醇，混匀，静置8 IOmin,离心； (6)弃掉离心后的上清，加入乙醇，离心； (7)倒出离心后的液体，再离心，得离心沉淀物，即为RNA，晾干2 3min，加入50μ IDEPC水溶解RNA ； (8)在步骤(7)所得的RNA溶液中加入bufferRDD>DNase储存液和RNase_freeddH20,于20°C 25°C孵育8 lOmin，再加入20mM的EDTA，60°C 65°C孵育8 lOmin，之后置于-70°C保存备用；其中，所述的RNA溶液、buffer RDD、DNase储存液、RNase-free ddH20和20mM的EDTA五者的体积比为19 21:3 5:1:14 16:3 5。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述的准备新鲜红花檣木叶片是从健康红花檣木植株上选取10 15cm带叶片的枝条快速插入装有1/3 1/4高度蒸懼水的烧杯中，备用。3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述的准备新鲜红花檣木叶片是从红花檣木枝条上选取健康叶片快速装入密封袋，并将密封袋放入装满碎冰的泡沫盒，备用。4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的离心条件为4°C,12000rpm,离心I 2min ;步骤(4)和(5)所述的离心条件为4°C, 12000rpm,离心8 IOmin ;步骤(6)所述的离心条件为4°C, 5000rpm,离心3 5min。5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(8)中所述RNA溶液、bufferRDD、DNase储存液、RNase-free ddH20和20mM的EDTA五者的体积比为20:4:1:15:4。全文摘要本专利技术公开了一种红花檵木叶片总RNA的提取方法。采用本专利技术的提取方法提取的红花檵木RNA纯度高，杂质少，以α-tubulin、β-actin、18S rRNA、GAPDH等几个常用的内参基因特异引物序列进行RT-PCR检测，能够得到比较亮的与引物设计的预期片段大小一致的特异条带(见图2),即本试验所用的方法得到总RNA完整性好，能用于后续的RT-PCR扩增，进行相关基因的表达分析。文档编号C12N15/10GK102911930SQ20121034667公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日专利技术者于晓英, 张力, 符红艳, 许威, 陈己任, 李达, 陈海霞 申请人:湖南农业大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种红花檵木叶片总RNA的提取方法，包括如下步骤：（1）准备新鲜红花檵木叶片；（2）称取50～100mg步骤（1）所述的叶片，放入1.5ml离心管，用液氮浸泡离心管内叶片8～10s后，将叶片快速研磨成粉状；（3）向装有粉状叶片的离心管中加入0.3～0.5ml植物总RNA提取剂，静置3～5min，离心，上清转至无RNase离心管；（4）向装有上清的无RNase离心管中加入NaCl，混匀，再加入氯仿，混匀，离心；（5）取离心后的上层水相，转移至另一无RNase离心管，加入异丙醇，混匀，静置8～10min，离心；（6）弃掉离心后的上清，加入乙醇，离心；（7）倒出离心后的液体，再离心，得离心沉淀物，即为RNA，晾干2～3min，加入50μl？DEPC水溶解RNA；（8）在步骤（7）所得的RNA溶液中加入buffer？RDD、DNase储存液和RNase？freeddH2O，于20℃～25℃孵育8～10min，再加入20mM的EDTA，60℃～65℃孵育8～10min，之后置于？70℃保存备用；其中，所述的RNA溶液、buffer？RDD、DNase储存液、RNase？free？ddH2O和20mM的EDTA五者的体积比为19～21:3～5:1:14～16:3～5。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于晓英，张力，符红艳，许威，陈己任，李达，陈海霞，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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