本发明专利技术涉及一种具有杀灭植物病原体活性的蛋白、其编码基因及应用。本发明专利技术的蛋白对于棉铃虫等鳞翅目昆虫具有广泛的、较强的毒杀作用，可用于植物(作物)的虫害防治。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物基因工程或生物农药基因工程
具体的说，涉及一种具有杀灭植物病原体活性的蛋白、其编码基因及应用。
技术介绍
近几十年来，对昆虫病原微生物为主题的微生物杀虫剂展开了广泛的研究，微生物杀虫剂由于所使用的病原微生物不同，其杀虫原理和机制也有所不同。现已证实细菌杀虫剂的杀虫机制通常与细菌毒素蛋白有很大的关系(喻子牛，苏云金芽孢杆菌的生产与应用.北京农业出版社1993)。自从第一个毒素蛋白白喉毒素被发现以来，相继在各种细菌中又发现了几百种毒素蛋白，并对其中部分毒素蛋白开展了详细的研究工作。至今发现的细菌毒素蛋白大多对人畜有致毒作用，而专一性作用于昆虫的细菌毒素蛋白还所知甚少，而且主要集中于芽孢杆菌属的细菌，如苏云金芽孢杆菌、球形芽孢杆菌。目前应用最广泛的细菌杀虫剂为苏云金芽孢杆菌制剂。苏云金芽孢杆菌的杀虫作用主要由于它在芽孢形成期间产生杀虫蛋白晶体对多种昆虫具有毒力。由于其杀虫晶体蛋白作用专一，对环境无害，人畜安全，苏云金芽孢杆菌已在许多国家广泛推广。细菌杀虫毒素蛋白的发现和研究，为研制新型高效生物杀虫剂奠定了基础。随着分子生物学的发展和基因工程技术的日益成熟，已有许多的细菌杀虫毒素蛋白基因被克隆，例如已从苏云金芽孢的各种菌株中克隆了 100多个杀虫晶体蛋白基因(FeitelsonJ. S,Payne J, Kim L. Bacillus thuringiensis Insects and beyond. BioTechnology,1992,10 :271-275)。这些毒素蛋白在植物转基因抗虫方面得到了广泛的应用缺少，然而，这些基因一般均为国外专利所保护，我国缺少具有自主知识产权的抗虫基因。另一方面，由于有限的几种高效活性杀虫蛋白基因的广泛使用，使得害虫对杀虫蛋白的抗性问题已经出现。因此寻找新的杀虫微生物、杀虫物质及新的毒素蛋白基因已成为国际研究热点。最近研究表明，某些肠杆菌科沙雷氏菌属细菌对某些鳞翅目、鞘翅目、直翅目和膜翅目害虫有致死作用。在嗜虫沙雷菌(serratia entomophila)杀虫蛋白的研究方面，UPADHYAYA等从嗜虫沙雷菌中鉴定出一段am_l基因组片段，它所编码的蛋白与嗜虫沙雷菌的杀虫活性密切相关(N. M. UPADHYAYA 等,Identification of a Serratia entomophilaGenetic Locus Encoding Amber Disease in New Zealand Grass Grub(Costelytrazealandica), Journal of Bacteriology, 1992，174 :1020-1028)。HURST 等在在嗜虫沙雷菌中找到了一个编码杀虫蛋白的长达115kb的大质粒pADAP，从中鉴定出了三个杀虫蛋白基因S印A，S印B，和S印C，由它们编码的三个蛋白共同作用可以引起新西兰草地蛴螬的琥拍病(MARK R. H. HURST 等，Plasmid-Located Pathogenicity Determinants of Serratiaentomophila,the Causal Agent of Amber Disease of Grass Grub, Show Similarity tothe Insecticidal Toxins of Photorhabdus luminescens, Journal of Bacteriology,2000,182 :5127-5138) 0随后，他们又从这个质粒中克隆到了一段的基因组片段amb_2，它编码的蛋白可以抑制新西兰草地蛴螬进食(MARK R. H. HURST等，Cloning Serratiaentomophila Antifeeding Genes—a Putative Defective Prophage Active against theGrass Grub Costelytra zealandica, Journal of Bacteriology，2004，186 :5116-5128)。然而，对于嗜虫沙雷菌中含有的杀虫蛋白还需要进行进一步的开发和研究，以期找到新的或更为有效杀虫物质或毒素蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有杀灭植物病原体活性的蛋白、其编码基因及应用。在本专利技术的第一方面，提供一种分离的蛋白，该蛋白选自下组(a)如SEQ ID NO 2氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQ ID NO 2氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个；更佳地1_10个；更·佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。在本专利技术的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组(a)编码所述蛋白的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白。在另一优选例中，该多核苷酸的序列如SEQ ID N0:1所示。在本专利技术的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体；或其基因组中整合有所述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种所述的蛋白的制备方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的蛋白。所述的蛋白的用途，用于杀灭植物病原体。在另一优选例中，所述的植物病原体是鳞翅目害虫。在本专利技术的另一方面，提供一种农药组合物，它含有安全有效量(如0. 00005-10%% (w/w))的所述的蛋白、或所述的宿主细胞或宿主细胞表达产物以及农药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的宿主细胞表达产物包括宿主细胞破碎后上清液、细胞破碎后沉淀、宿主细胞分泌产物、细胞发酵液等。在另一优选例中，所述的农药组合物pH值为6. 0-9. O ;或其温度为20_55°C。在另一优选例中，所述的农药组合物是PH值为7. 0-8. O ;更佳地其pH值为7. 5。在另一优选例中，所述的农药组合物是温度为30_45°C ;更佳地其温度值为40°C。在另一优选例中，所述的农药学上可接受的载体中包括蛋白稳定剂。在本专利技术的另一方面，提供一种杀灭植物病原体的方法，将所述的蛋白、或所述的宿主细胞或宿主细胞表达产物、或所述的农药组合物施加于植物病原体。在另一优选例中，所述的施加包括注射、喷洒、喂食。在本专利技术的另一方面，提供一种提高植物抗病性的方法，包括将所述的多核苷酸转入植物中。在另一优选例中，所述的方法包括(I)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的多核苷酸；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(I)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞或组织或器官。在另一优选例中，所述方法还包括(3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物细胞或组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。在本专利技术的另一方面，提供由所述的提高植物抗病性的方法获得的转基因植物。·本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图I为本专利技术的嗜虫沙雷菌杀虫蛋白基因在大肠杆菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的蛋白，其特征在于，该蛋白选自下组：(a)如SEQ？ID？NO：2氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQ？ID？NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周志华，孙琴，严兴，王钱福，钱昌丽，王成树，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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