本发明专利技术公开了光敏感基团保护的功能基团亚磷酰胺及其制备方法和应用，属于核苷酸的固相合成领域。本发明专利技术式Ⅰ或式Ⅱ所示结构的亚磷酰胺化合物均有邻硝基苯乙醇的母体结构，具有光切割活性，在寡聚核苷酸的固相合成中可作为光活性保护基，将其作为最后一个单体加入到ODN的5′端，能够保护磷酸基、氨基、羧基、巯基或羰基。试验结果表明，本发明专利技术式Ⅰ或式Ⅱ所示结构的化合物在寡聚核苷酸的固相合成中作为最后一个单体加入到ODN的5′端所得到的寡聚核苷酸产物经过光照后能脱去保护并在5′端接上相应的功能分子或标记物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及亚磷酰胺化合物，尤其涉及光敏感基团保护的功能基团的亚磷酰胺化合物及其制备方法，本专利技术还涉及该亚磷酰胺化合物在寡聚核苷酸固相合成及5'端功能化中的应用，属于寡聚核苷酸的固相合成及功能化领域。
技术介绍
光活性基团指在光子激发下，能够通过形成自由基或异裂中间体，发生化学变化的分子结构。它使在复杂体系中，尤其是在生理环境下，利用光控制小分子或生物大分子的变化成为可能。普遍认为，与温度、酸碱度等其它的调控手段相比，光调控具有定位准确，调控及时，对体系影响小等诸多优点。通常所指的光活性基团可分为两类，即光异构化基团和光可切除基团。前者的光化学过程是可逆的，后者则是不可逆的化学过程。光可切除基团(caged/caging moieties)的概念最早由J. F. Hoffman于1978年提出1，这类基团对340-370nm范围内的光敏感，能够有效地吸收这种能量的光子。最常见的光可切除基团是邻 硝基苯基及其衍生物，此外还有对羟基苯乙酰氧基、香豆素类、咕吨酮乙酸类化合物等。由于邻位硝基的存在，在光激发后，邻硝基苯乙醇类化合物形成五元环状中间体，进而得到邻亚硝基苯乙酮类化合物，与化合物中的其它部分断开。由于邻硝基苯乙醇及其衍生物的结构相比其它光可切除基团在合成中或生理环境下较为稳定，因此在大多数生物体系中被广泛采用，如ATP，DNA, RNA,蛋白质，适配体等。寡聚核苷酸可以用来做PCR引物，用于核酸序列检测的探针、等位基因特异的寡聚核苷酸分析(Allele-specificoligonucleotide, ASO)、单喊基多样性分析(Singlenucleotide polymorphism, SNP)、反义寡聚核苷酸,其在分子生物学领域有广泛的应用。近几十年来，寡聚核苷酸在分子生物学中发挥着越来越重要的作用，逐渐成为一种非常有效的研究工具。特别是近年来，相关的研究多集中在如何利用寡聚核苷酸从基因水平上研究各种疾病的产生机理及其相关基因的表达网络，并使其通过调节基因的表达量来预防、诊断和治疗相关疾病，作为药物研发的另一种思路。寡聚核苷酸功能化的传统方法和应用一般地，5'端的功能化是在寡聚核苷酸合成后加入含磷试剂的小分子带保护基的官能团，脱保护后再经由这些官能团连接其它功能分子。如5'氨基有对甲氧基三苯基(MMTr)保护和三氟乙酰(TFA)保护的模块，选用何种保护基由寡聚核苷酸的后处理决定。连接臂一般为6个碳，12个碳的连接臂用于某些特定情形，如在近距离会发生荧光淬灭的分子内。5'巯基有三苯基(Tr)保护基和二硫键保护两种模块，与MMTr不同，Tr对酸稳定，需小心地用硝酸银将其脱去，过量的硝酸银用TCEP沉淀后离心除去，而此步中过量的TCEP需经脱盐除掉。为保证硫醚键或二硫醚键不被氧化，合成循环中最后一步需用0. 2M的碘液。而二硫键保护的模块可用TCEP断开，脱盐后直接使用。末端为巯基的ODN可继续与荧光素、生物素或金属纳米粒结合，用于DNA芯片分析，荧光探针等分子生物学检测。在一段末端为氨基的寡聚核苷酸中连入含二硫醚的戊酸NHS活化物后能与金、银纳米粒表面结合，形成两个硫-金键，结合的效率可达91%，而单一巯基则仅48%。这种强的DNA-金表面结合模式为DNA控制的纳米粒自组装提供了另一种可行的策略。最初引入5'端磷酸基时需使用含有砜的磷试剂，但如果合成最后DMTr在ODN上，则氨水在会将该保护基脱下暴露磷酸基，这样会给反相HPLC的纯化造成困难。将邻硝基苄醇结构保护的氨基和羧基与胸腺嘧啶单体的碱基连接，寡聚核苷酸合成后并光照处理后，即可暴露氨基和羧基。在链中加入功能分子还可通过修饰的DNA单体实现，即先将光活性基团连入胸腺嘧啶2'位置进行DNA合成，光脱保护后再连入功能分子。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种能够应用于寡聚核苷酸的固相合成及功能化的光敏感基团保护的功能基团的亚磷酰胺化合物；本专利技术的目的之二是提供一种合成所述亚磷酰胺化合物的方法；·本专利技术的目的之三是将所述的亚磷酰胺化合物应用于寡聚核苷酸的固相合成及功能化。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的应用于寡聚核苷酸固相合成及功能化的光敏感基团保护的功能基团的亚磷酰胺化合物，为式I或式II所示结构的化合物权利要求1.光敏感基团保护的功能基团的亚磷酰胺化合物，其特征在于，其为式I或式II所示结构的化合物2.一种合成权利要求I所述式I化合物的方法，其特征在于，包括将邻硝基苯乙酮还原后得到邻硝基苄醇；将邻硝基苄醇在氮气保护下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2-氰乙基二异丙氨基膦氯和TEA，室温条件下进行反应，即得。3.一种合成权利要求I所述式I化合物的方法，包括 (I)将邻硝基苄醇与DSC形成中间体，直接与6-氨基己醇作用得I-(2-硝基苯基)乙基6-羟基己胺基碳酸酯；(2)将1-(2-硝基苯基)乙基6-羟基己胺基碳酸酯在氮气保护下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2-氰乙基二异丙氨基膦氯和TEA，室温进行反应，即得。4.一种合成权利要求I式I所示化合物的方法，包括 (1)邻硝基节醇经过溴代得到1-(1-溴乙基)-2-硝基苯；将1-(1-溴乙基)-2-硝基苯(2)和被硅烷保护的6-羟基己酸在丙酮和无机碱作用下得到6-(6-(叔丁基二甲基硅氧)己酸I-(2-硝基苯基)乙酯；将6-￠-(叔丁基二甲基硅氧)己酸I-(2-硝基苯基)乙酯脱去娃烧保护基得到6-轻基己酸1-(2-硝基苯基)乙酯； (2)6-羟基己酸1-(2-硝基苯基)乙酯在氮气保护下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2-氰乙基二异丙氨基膦氯和TEA，室温进行反应，即得。5.一种合成权利要求I式I所不化合物的方法，包括(1)将1-(1_溴乙基)-2-硝基苯被6-疏基己醇未核取代得到6-I-己醇；(2)6-I-己醇在氮气保护下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2-氰乙基二异丙氨基膦氯和TEA，室温进行反应，即得。6.一种合成权利要求I式I所示化合物的方法，包括(I)邻硝基苄醇的羟基被DSC活化后，得到S_6_轻己基0_1_(2_硝基苯)乙基硫代碳酸酷；(2) S-6-轻己基0_1_(2_硝基苯)乙基硫代碳酸酯在氮气保护下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2-氰乙基二异丙氨基膦氯和TEA，室温进行反应，即得。7.一种合成权利要求I式II所示化合物的方法，包括(I)邻硝基苯基乙二醇和4-羟基-2- 丁酮溶于THF中，在对甲基苯磺酸的催化和分子筛的脱水下，得到4-羟基丁 -2-酮1-(2-硝基苯基)-1，2_乙二醇缩酮；(2) 4-羟基丁 -2-酮I-(2-硝基苯基)-1，2-乙二醇缩酮在氮气保护下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2-氰乙基二异丙氨基膦氯和TEA，室温条件下进行反应，即得。8.按照权利要求2-7任何一项所述的方法，其特征在于所述的室温的温度范围为20-30°C，优选为 25°C。9.一种寡聚核苷酸，其特征在于含有权利要求I所述的亚磷酰胺化合物。10.权利要求I所述的亚磷酰胺化合物在寡聚核苷酸的固相合成及5'端功能化中的应用，包括在寡聚核苷酸的固相合成中，将其作为最后一个单体加入到寡聚核苷酸的5'端；光照后脱去保护，再连上相应的功能分子或标记物。全文摘要本专利技术公开了光敏感基团保护的本文档来自技高网...
【技术保护点】
光敏感基团保护的功能基团的亚磷酰胺化合物，其特征在于，其为式Ⅰ或式Ⅱ所示结构的化合物：其中，R1选自氢、CH3、COOCH3；R2选自氢或R3选自氢或烷氧基；R4选自氢或烷氧基；或R3？R4是？OCH2O；X是氧或氮；Y是碳、氮或硫；Z是CH2或OCH2CH2；n为1？6的任意整数；R2选自氢或R3选自氢或烷氧基；R4选自氢或烷氧基；或R3？R4是？OCH2O；R5是氢，CH3或苯基；Z是CH2或OCH2CH2；n为1？6的任意整数。FDA00001674474700011.jpg,FDA00001674474700012.jpg,FDA00001674474700013.jpg,FDA00001674474700014.jpg
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汤新景，苏蒙，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：
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