标记化探针-水溶性载体复合物制造技术

本发明专利技术的目的在于高再现性地制作标记化探针-载体复合物，其用于对被测物质进行高灵敏度且稳定的检测和测定。其中，在标记物与探针-水溶性载体的结合中，利用亲和素、链霉亲和素等亲和素类与生物素的特异性结合，且在与载体结合之前进行该亲和素类与探针的结合。即，在使跟被测物质结合的物质与亲和素类结合之后，使该结合体与高分子水溶性载体结合来制作亲和素化探针-水溶性载体复合物，通过在该亲和素化探针-水溶性载体复合物中混合生物素化标记物，再现性良好地得到可藉由亲和素类与生物素的特异性结合来高灵敏度地检测和测定出被测物质的稳定的标记化探针-水溶性载体复合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在水溶性载体上结合两种以上的探针、进一步结合标记物而成的；利用该方法制作的标记化探针-水溶性载体复合物；及其使用方法。通过使用该标记化探针-水溶性载体复合物，能够高灵敏度地进行稳定的检测和测定。
技术介绍
在使用跟被测物质特异性结合的探针与标记物的结合物、以被测物质与标记物藉由探针的结合量为指标来对被测物质进行检测和测定的方法中，其灵敏度通常由探针和标记物的分子数来决定。即，标记物相对于I分子探针所结合的分子数是有限的，该比例决定了灵敏度。·因此，通过对探针本身进行聚合化来制作聚合物，由此会增大分子量，通过增加与该聚合物结合的标记物的分子数来进行反应性得到提高的高灵敏度化(专利文献I)。但是，探针聚合化的调节并不容易，尚未达到实用化。另外还提出了将酶标记物和探针单独地共价键合在聚赖氨酸、氨基葡聚糖等载体上所得到的分子量增大、标记物的结合数多的标记物探针复合物(专利文献2)。但是，利用该技术尽管可增加反应性，但空白值下的反应也会增加，尚未达到检测和测定时的高灵敏度化。进一步提出了下述提案使酶标记物结合在聚赖氨酸等载体上并藉由载体上的标记物从而结合有探针的标记物-探针复合物(专利文献3);使探针结合在葡聚糖等载体上，藉由载体上的探针从而结合有标记物的水溶性载体-探针复合物(专利文献4);使亲水性的中介物结合在载体上从而在中介物上结合有探针和检测标记的标记物的探针复合物(专利文献5);在藉由酶标记物结合有2分子以上的载体的复合物上结合有探针的嵌段化标记物探针(专利文献6)。但是，上述现有技术中还存在反应性增加的同时空白值下的反应也会增加这样的技术课题，在以信号/噪音比的形式来评价反应性的情况下，难以得到高灵敏度且稳定的复合物。并且，在复合物的形成中，若首先进行载体与探针或标记物的结合，则由于载体的多官能性而难以再现性良好地制作所期望的复合物。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开平11-295313号公报专利文献2 :日本特开2000-88850号公报专利文献3 :日本特开2001-181299号公报专利文献4 :日本特开2003-194821号公报专利文献5 :国际公开2006/011543专利文献6 :国际公开2006/07073
技术实现思路
专利技术所要解决的课题为了使用跟被测物质特异性结合的探针与标记物的结合物，以被测物质与标记物藉由探针的结合量为指标，高灵敏度地进行被测物质的检测和测定，在I分子探针与标记物的结合物中必须含有大量的标记物。因此，需要制作大分子的探针与标记物的结合物。但是，在使用会形成大分子结合物的载体的情况下，尽管反应性增加，但空白值下的反应也增加，结果难以得到高灵敏度且稳定的复合物。另外，若作为形成复合物的最初阶段进行载体与探针或标记物的结合，则由于载体的多官能性而难以再现性良好地制作所期望的复合物。因此，期待稳定地制作可解决上述课题的结合物和稳定地制作该结合物的方法。解决课题的手段本专利技术人想到，在标记化探针-载体复合物的制作中，在探针与标记物的结合中·利用亲和素类与生物素的特异性结合，并且发现，通过在与载体结合之前进行亲和素类与探针的结合，能够再现性良好地制作灵敏度极高且稳定的复合物。此外发现，在为了化学结合而进行探针的化学修饰时，向探针导入硫羟基不会对探针的结合能力带来影响；进而通过使用水溶性载体作为载体，构建出了在以高灵敏度稳定地检测和测定中有用的标记化探针-水溶性载体复合物。S卩，本专利技术涉及包括以下工序的。工序I.使具有硫羟基、可与被测物质结合的探针与具有马来酰亚胺基的亲和素类结合，制成探针结合体；工序2.接下来，使具有硫羟基的所述探针结合体与具有马来酰亚胺基的高分子水溶性载体结合，制成探针结合体-水溶性载体复合物；和工序3.进一步将所述探针结合体-水溶性载体复合物与生物素化标记物混合，使探针结合体-水溶性载体复合物的亲和素类与生物素化标记物的生物素结合。本专利技术还涉及通过该工序制作的标记化探针-水溶性载体复合物。本专利技术进一步涉及使用了通过上述工序制作的标记化探针-水溶性载体复合物的测定法、免疫测定法或高灵敏度测定法。本专利技术中，“探针”意味着与被测物质相互作用的结合伙伴，作为非限定性示例，可以举出抗体或者抗体片段、蛋白G、蛋白A、蛋白L、凝集素或受体等。另外，作为抗体或抗体片段的非限定性示例，可以举出Fab’、F(ab’)2、Fab或IgG等。另外，作为该抗体或抗体片段，可以使用两种以上的抗体或抗体片段。本专利技术中，“亲和素类”意味着为低分子碱性糖蛋白的亲和素、与其类似的蛋白质或其片段等与生物素化合物形成稳定复合物的物质，作为该“亲和素类”的非限定性示例，可以举出亲和素或链霉亲和素等。本专利技术中，“水溶性载体”优选分子量为50万以上。作为本专利技术中水溶性载体的非限定性示例，可以举出葡聚糖、氨基葡聚糖、糊精、集束糊精(Cluster Dextrin)、聚蔗糖或普鲁兰多糖等。本专利技术中使用“生物素化标记物”。此处的“生物素”为维生素B复合物的一种，已知与亲和素有非常强力的结合。作为本专利技术中的“生物素化标记物”的非限定性示例，可以举出生物素化荧光素酶、生物素化碱性磷酸酶、生物素化POD(过氧化物酶，peroxidase)、生物素化GOD (葡糖氧化酶，glucose oxidase)、生物素化FITC (异硫氰酸突光素，fluorescein isothiocyanate)、生物素化B丫唳鐵、生物素化B丫唳鐵衍生物或生物素化三(2，2’-联吡啶)钌(II)等。该“生物素化标记物”中的生物素与标记物的结合中，可以利用包括化学修饰等已知的任意手段，特别优选利用基因重组。这是因为，由于不进行化学结合所用的化学修饰，不会降低该标记物的活性。本专利技术的工序I中，在可与被测物质结合的探针不具有足够的硫羟基的情况下，首先向该探针导入硫羟基。在硫羟基的导入中可以使用任何已知的方法，在探针为抗体或抗体片段的情况下，使用2-巯基乙醇等还原剂，通过对内在的二硫键进行还原来导入硫羟基，从而可使得对探针结合能力的影响为最小限，因而是特别有利的。接下来，向亲和素类中导入马来酰亚胺基。马来酰亚胺基的导入可以使用任何已知的方法，例如可使用Sulfo-KMUS(同仁化学社制造)之类的已知的马来酰亚胺试剂。 在具有硫羟基且可与被测物质结合的探针与具有马来酰亚胺基的亲和素类的结合中，可以使用任何已知的方法。例如，可将探针和亲和素类分别在适当浓度下溶解于缓冲液中，通过使该溶解液发生反应来进行结合反应。另外，为在以后的工序中回避非特异反应，可以在上述结合反应完成后使用2-巯基乙醇等硫醇试剂来封闭未反应的马来酰亚胺基。封闭后的探针-亲和素类结合体可以通过凝胶过滤等已知的方法进行精制。本专利技术的工序2中，首先向工序I中制作的探针-亲和素类结合体中导入硫羟基。硫羟基的导入可以采用例如使用2-亚氨基硫烷等已知的任意方法。向水溶性载体中导入马来酰亚胺基时可以使用任何已知的方法。例如，通过使水溶性载体与酸反应来导入羧基，通过透析等去除该酸后，使用乙二胺等已知的氨基导入试齐U，将羧基置换为氨基。置换后，通过透析等除去未反应的氨基导入试剂，加入已知的马来酰亚胺试剂进行反应，由此可得到具有马来酰亚胺基的水溶性载体。具有硫羟基的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：大广义幸，高安进，
申请(专利权)人：荣研化学株式会社，株式会社先端生命科学研究所，
类型：
国别省市：