移植片的评价方法技术

本发明专利技术涉及一种对包含具有多核化功能的细胞的移植用试样的移植适宜性进行评价的方法，其包括求出多核化能力的工序，所述多核化能力为表征所述具有多核化功能的细胞进行多核化的能力的指标，及用于该评价的系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及评价移植片的移植适宜性的方法。
技术介绍
虽然近年心脏病治疗在不断革新进步，但仍然没有建立起重症心力衰竭的治疗体系。作为心力衰竭的治疗法，进行的是利用β阻滞剂、ACE抑制剂的内科治疗，但对这些治疗不很奏效的重症化的心力衰竭而言，进行辅助人工心脏、心脏移植等置换型治疗，也即外科治疗。这类成为外科治疗对象的重症心力衰竭包括多种起因，如进行性心脏瓣膜症、高度的心肌缺血所致、急性心肌梗塞和其合并症、急性心肌炎、缺血性心肌病(ICM)、扩张型心肌病(DCM)等所致的慢性心力衰竭及其急性加重等。 根据上述原因和重症度，而应用瓣膜成形术/置换术、冠状动脉架搭桥术、左心室成形术、机械辅助循环等。其中，对于ICM、DCM所致的高度左心室功能低下导致的心力衰竭而言，仅仅心脏移植和利用了人工心脏的置换型治疗可以视为其的有效治疗方法。但是，这些重症心力衰竭患者的置换型治疗存在慢性的供体不足、需要持续进行免疫抑制、引发合并症等很多需要解决的问题，难以称为适用于所有重症心力衰竭的普适治疗法。由于这样严峻的心脏移植现状，在一个时期内曾尝试进行巴提斯塔(Batistaoperation)术等其它外科治疗，虽然其作为心脏移植的代替治疗而广受关注，但最近这些手术的限制也逐渐显现，需要在手术法的改良和适应性的确立方面继续努力。另一方面，最近认为，作为重症心力衰竭治疗的解决方案，新型再生医疗的开展是必不可少的。在重症心肌梗塞等中，心肌细胞陷入功能衰竭，进而发生成纤维细胞的增殖、间质纤维化，而呈现心力衰竭。随着心力衰竭的加重，心肌细胞受损直至细胞死亡，由于心肌细胞几乎不发生细胞分裂，因此心肌细胞数减少，心脏功能下降进一步加剧。对于这类重症心力衰竭患者的心脏功能恢复而言，细胞移植法被认为是有用的，并已经开始了自身骨骼肌成肌细胞的临床应用。近年，作为其一个例子，通过使用利用组织工程学的温度响应性培养皿，提供一种包括来自于成体心肌以外部分的细胞的、能够用于心脏的三维结构的细胞培养物和其制造方法(专利文献I)。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开2007 - 528755号公报
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的目的在于，提供一种简便且准确地评价包含具有多核化功能的细胞的移植用试样的移植适宜性的方法。用于解决问题的方案如上所述，虽然近年利用再生医疗已开发了应可解决细胞移植的各种问题的各种移植片、尤其是片状细胞培养物等，但现状是所述移植片依然难以制造，成本也高。但是，本专利技术人即使在以同样的方法对利用同样的方法制造的移植片进行移植时，遭遇了细胞的存活率、组织化的状态方面产生差异这一此前未知的新课题。为了解决所述课题持续进行了研究，发现骨骼肌成肌细胞的片状细胞培养物中，当将片状的骨骼肌成肌细胞解离、在培养基中孵育该解离细胞时，在形成融合细胞更多的群中，产生更多的促进心肌再生的细胞因子，进而继续进行深入研究，从而完成了本专利技术。S卩，本专利技术涉及以下方案。(I) 一种对包含具有多核化功能的细胞的移植用试样的移植适宜性进行评价的方法，其包括求出多核化能力的工序，所述多核化能力为表征所述具有多核化功能的细胞进行多核化的能力的指标。(2)根据(I)的方法，求出多核化能力的工序包括(i)将I或2个以上的所述移植用试样的一部分解离成单个细胞的步骤、(ii)对(i)中解离后的细胞进行接种、孵育的步骤、及(iii)检测(ii)中孵育的细胞培养物中的多核细胞的步骤，所述方法包括对求出的多核化能力和预先设定的阈值进行比较的工序。(3)根据(I)或(2)的方法，其中，具有多核化功能的细胞为骨骼肌成肌细胞。(4)根据(I) (3)的方法，其中，多核化能力为多核化率。(5)根据(I) (3)的方法，其中，具有多核化功能的细胞为骨骼肌成肌细胞，求出的多核化能力为多核化率，将该多核化率大于预先设定的阈值的情况评价为适合用于心脏移植。(6)—种对包含具有多核化功能的细胞的移植用试样的移植适宜性进行评价的系统，其包括用于检测多核细胞的检测部、及用于求出多核化能力的计算部。(7)根据(6)的系统，其中，检测部具有用于 解析所拍摄的细胞图像的图像解析部。(8)根据(7)的系统，其中，图像解析部含有用于拍摄进行了染色的细胞的拍摄部，利用该图像解析部进行的解析包括对所述拍摄部拍摄的细胞图像中的细胞区域及细胞核区域进行区分的工序。专利技术的效果根据本专利技术，能够简便地从移植片中筛选具有更高存活能力及组织化能力的移植片，其结果是能够提高通过移植移植片而进行的再生医疗的治疗效果。此外，通过使用本专利技术的评价方法，能够在移植片制造中不断地提供高品质的移植片。此外，通过能够用于本专利技术方法的检测多核细胞的系统，能够简便且准确地检测多核细胞，能够进一步提高本专利技术的评价精度。附图说明图I为表示2种骨骼肌成肌细胞(myoA、myoB)的多核化率的图表。对比myoA和myoB可知myoB的多核化率更高。图2为表示由上述多核化率不同的两种骨骼肌成肌细胞(myoA、myoB)构成的、2种片状骨骼肌成肌细胞培养物(片A、片B)的细胞因子产生能力的差异的图表。可知，由多核化率高的myoB构成的片B的细胞因子产生量显著高于由多核化率低的myoA构成的片A。图3 a)是多核化后的骨骼肌成肌细胞的图像。这样的图像是在本专利技术系统的一个方式中拍摄的。b)为在本专利技术的一个方式中对a)的图像进行多核细胞检测而成的图。图像中，首先区分细胞区域，进而区分细胞区域中所存在的核区域，对封闭的细胞区域部分中所存在的封闭的核区域的数目进行计数。将具有多个核区域的细胞区域识别为多核细胞。该图的情况下，多核细胞计数为8个。图4表示本专利技术系统的一个方式中的、图像解析处理的流程图。图中，各条 件分别为，条件I :图像中的核数为100个以下，条件2 :图像中的核数为I个以上，条件3 :图像中无细胞的区域所占的面积小于50%，条件4 :图像中不存在除无细胞的区域、细胞质及核以外的区域。具体实施例方式本专利技术涉及一种对包含具有多核化功能的细胞的移植用试样的移植适宜性进行评价的方法，其包括求出多核化能力的工序，所述多核化能力为表征所述具有多核化功能的细胞进行多核化的能力的指标。本专利技术中的移植用试样典型的是由培养的细胞和/或其产生物构成的，也包括用于填补和/或支持生物体的规定部(例如患部等)的各种材料(填补材料、支持材料)等。移植用试样典型的是用于哺乳动物、例如人和家畜等的疾病、伤病的治疗等，但并非仅限于此。移植片的形状没有特别限定，可以是例如片状、膜状、块状、柱状等各种形状。本专利技术中，在提及移植用试样时，既可以是指I个移植片，也可以是指由多个移植片构成的移植片集合体。移植片集合体较典型的可以列举出例如同一批次中所制造的移植片的集合体等，但并非仅限于此。本说明书中，“多核化”是指一个细胞中含有多个细胞核的状态。多核化的原因可以认为是融合、细胞分裂、核内DNA的片段化、细胞或核的摄入、分化等各种原因。本说明书中的“多核化”是指一个细胞中含有多个细胞核的状态，而不论原因如何，因此“多核细胞”是指具有多个细胞核的所有细胞。即，该
中，虽然在语言上将原生动物、菌类中产生的具有多个核的细胞即“多核体”与昆虫、动物等中产生的具有多个核的细胞即“合胞体(也称本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：坂本健太，
申请(专利权)人：泰尔茂株式会社，
类型：
国别省市：