本发明专利技术公开了一种检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451，其miRNA序列为：?aaaccguuaccauuacugaguu。本发明专利技术还同时公开了上述标记物miR-451的用途，制备用于筛查卵巢肿瘤或辅助卵巢肿瘤病理鉴定和临床诊断的试剂盒。试剂盒包括反转录系统和引物系统/引物探针系统；反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂；引物系统由miR-451的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物组成；引物探针系统由miR-451的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物和探针以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物和探针组成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和医学领域，涉及ー种卵巢癌肿瘤的生物标记物-血清microRNA-451 (miR-451)，及其筛选方法和在辅助卵巢筛查与临床诊断中的应用。
技术介绍
卵巢癌(ovarian carcinoma)是女性生埴器官常见的肿瘤之一,大多数是由于卵巢上皮细胞和包涵囊肿组织上皮细胞在多种致癌因子作用下，发生了基因突变，致使细胞增生失控。卵巢癌是死亡率极高的妇科恶性肿瘤，其组织学形态多种多祥，是ー类高度异质性的肿瘤，具有发病率高、但病程进展缓慢、早期症状不易察觉；且侵袭转移能力较强、自然生存期长等特点。在临床检查中，多采用CA-125水平检测、超声检查、以及联合CA-125动态监测和盆腔超声检查及彩色多普勒血流显像等检测方法尽可能的提高卵巢检出率。但目 前80%的卵巣癌病人发现时已是中晩期(II -IV)，采取肿瘤细胞减灭术以及化疗患者的5年存活率仅为20%左右，且治疗比较复杂，预后效果比较差。虽然早期诊断及辅助化疗和激素治疗使得卵巣癌的死亡率有所降低，但在导致女性死亡的恶性肿瘤中卵巢癌仍居世界前列。MiRNA(MicroRNA)是ー类生物体内自然形成的小分子非编码RNA，參与调节其特异靶基因的表达，从而控制蛋白的产生，具有调节发育时序，细胞増殖，分化，代谢，凋亡与应激以及參与脊椎动物心脏、肌肉以及神经系统的形成，同时调控肿瘤发生的功能。约50%的已知人类miRA基因定位于和肿瘤相关的染色体区域，而不断累积的研究成果也已充分证实miRNA的异常表达与肿瘤的发生，发展密切相关。高通量测序是基于传统的Sanger测序的基础上发展而来的分子生物学的分析方法之ー是，虽然此技术建立时间不长，但其发展速度相当快。该技术能够对数百万个分子进行同时测序。这使得对ー个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。高通量测序的具有传统测序法达不到的优点，首先，它是利用芯片技术进行测序，可以在数百万个点上同时阅读测序，把利用平行处理的方略读取结果，通量较高；其次，高通量测序具有精确地样本定量功能，其原理为样本的DNA或者RA被测序的次数反应了在样品中的丰度；同时高通量测序的成本相对较为低廉。对于miRNA序列较短、同源性高，利用芯片检测非常困难。而利用高通量技术不仅能够解决此问题，而且能够发现新的miRNA。利用此技术对卵巢肿瘤患者血清与健康血清样本分别进行测序，并对比其序列组成以及表达谱特征，对于发现生物标记物用于卵巢疾病的早期诊断有重要的意义。生物标记物是指能将机体的生理和病理状态区分开来的生物分子。筛选到可用于肿瘤早期发现、早期诊断的生物标记物可大大提高肿瘤患者的临床治疗效果。最新数据显示肿瘤组织普遍具有特征性的miRNA表达谱，即指肿瘤细胞某几种miRNA的表达水平常与同一组织中的正常细胞存在显著差异，而特征性的miRNA异常表达可望成为用于肿瘤的诊断、病理分级、临床分期、疗效与预后的生物标记物，显示了良好的临床应用前景。近年来研究人员发现在血浆和血清中也存在独立于细胞之外并且即使在严酷环境下也能明显保持稳定的miRNA分子，而作为生物检测样本，血清具有取材方便、无创伤性、并可连续的体外检测的优点，使得基于miRNA定性和定量检测技术寻找癌症特异性的血清miRNA作为分子标记的方法比传统的蛋白分子标记方法将更加有效，进而可以克服分子标记在抗体制备和定量分析上发展所遇到的瓶颈。因此，开发ー种可辅助卵巣癌筛查和诊断的血清miRNA作为生物标记物，具有广泛的科研价值和临床应用前景。目前已有实验证实，microRNA在血液中被有效地保护，使其免受在血液中大量存在的RNase的降解,表现出高度的稳定性。对于血液microRNA能否作为ー种无创性检测手段，目前的研究主要集中在癌症的早期诊断方面。然而，目前还没有将血清/血浆microRNA应用于卵巣疾病的辅助判断、危险度评价等方面的报道，若能筛选与卵巢组织病理状态有关的特异或异常表达的血清/血浆microRNA作为疾病检测的生物标志物，并研制相应的检测试剂盒，将会大大提升卵巢肿瘤疾病的检测水平。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供ー种具有较高靶向性、稳定性及高效率检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451及其用途。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-451，其 miRNA 序列为miR-451 :aaaccguuaccauuacugaguu。本专利技术还同时提供了上述血清学生物标记物的用途制备用于筛查卵巢肿瘤或辅助卵巢肿瘤病理鉴定和临床诊断的试剂盒。作为本专利技术的血清学生物标记物的用途的改进试剂盒包括反转录系统和引物系统/引物探针系统(即，引物系统和引物探针系统任选其一)；反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂；引物系统由miR-451的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物以及miR_16的茎环结构反转录引物、扩增引物组成；引物探针系统由miR-451的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物和探针以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物及探针组成。作为本专利技术的血清学生物标记物的用途的进ー步改进试剂盒还包括扩增系统；扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液。备注说明该扩增系统仅在引物探针系统中被用到。作为本专利技术的血清学生物标记物的用途的进ー步改进检测该标志物(标记物)的技术为基于茎环的反转录-荧光定量PCR技木。作为本专利技术的血清学生物标记物的用途的进ー步改进miR_451的茎环结构反转录引物，由以下核苷酸序列组成GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA。作为本专利技术的血清学生物标记物的用途的进ー步改进荧光定量PCR技术为DNA染料法。基于DNA染料法的荧光定量PCR检测方法，其中所使用的miR-451的cDNA扩增引物为miR-451 PCR 正向引物CGCGGAAACCGTTACCATTA ;miR-451 PCR 反向引物CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT ；基于TaqMan探针法的荧光定量PCR检测方法，其中所使用的引物为上述PCR引物(miR-451的cDNA扩增引物)，其中所使用的探针由以下核苷酸序列组成miR-451 荧光探针(6-FAM) ACTGGATACGACAACTCA (MGB)。备注说明以上括号内的内容代表探针合成方式。 在荧光定量PCR检测方法中，使用保守性miRNA (miR-16)作为内參照基因，其序列、茎环结构反转录引物、扩增引物和探针为夕U uauugcacuugucccggccugu ；茎环结构反转录引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA ；miR-16PCR 正向引物ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA ；miR-16PCR 反向引物TGGTGTCGTGGAGTCG ；miR-16 荧光探针(6-FAM) TTCAGTTGAGCGCCAATA (MGB)。本专利技术提供了一种检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物microRNA的筛选方法，对卵巣癌血清及正常血清进行solexa/illumina高通量测序，根据其表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR？451，其特征是miRNA序列为：miR？451：aaaccguuaccauuacugaguu。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁先锋，纪婷，孟丽，黄志雄，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：
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