与神经增殖迁移功能相关的6种大鼠源miRNA、相应的miRNA前体和反义寡核苷酸及用途制造技术

本发明专利技术提供了六种与大鼠坐骨神经离断过程中神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA、其前体序列和反义寡核苷酸序列，以及其在制备治疗周围神经损伤药物中的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学专业领域，涉及与神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸序列，以及在制备治疗神经再生药物中的用途。
技术介绍
周围神经损伤是常见的临床病症，而周围神经损伤后能够再生。miRNACmicroRNA,微RNA)是ー类具有19 25nt的RNA分子，由其前体分子在酶的作用下加工生成，其前体序列一般为70 120nt，广泛存在于生物体中。由于miRNA在各种生物体中具有保守性，因此普遍认为miRNA的功能是參与生命的ー些基本过程；在动物机体，miRNA通过转录后调控许多基因和蛋白的表达，在发育、分化、増殖、细胞的存活与癌变以及神经系统等发挥 重要作用。基础和临床研究表明，miRNA无论在正常生理过程还是在疾病过程中都是重要的调节因子。许多miRNA呈现组织特异性表达，因此在调控组织特异性和组织特异性基因的功能中发挥重大作用。近年来的研究发现miRNA与神经再生有着极为密切的关系，例如，miRNA在轴突生长及突触功能和可塑性等方面具有调控作用。虽然已经在各种生物发现了相当数量的miRNA，但仍不断有许多新的miRNA被挖掘，特别是那些在特定组织或特定阶段表达的miRNA。周围神经损伤和再生过程中，许多基因和蛋白的表达水平发生改变，而单个miRNA能够调控成千上百个靶基因的表达，因此作为转录后调控的miRNA的发现和功能鉴定对基于miRNA的周围神经损伤的修复具有十分重要的意义。
技术实现思路
由于各种意外造成的神经损伤的发病率逐年増加；而神经损伤后，再生能力差，致残率高，因此本专利技术针对神经损伤和治疗的生物分子的发现具有重要的应用价值。本专利技术以大鼠坐骨神经离断后的L4-6背根神经节和近端神经为材料进行miRNA的Solexa测序。测序结果经过SOAP软件与大鼠基因组序列比对，MIREAP软件分析miRNA前体的发夹结构，滤掉自由能大于-20 kcal/mol的候选miRNA,基于miRBasel7. O过滤掉已报道的miRNA，MiPred软件进一步过滤掉功能上非保守的虚拟的miRNA前体等生物信息学分析，并进ー步通过RT-PCR验证。然后对这些新的miRNA进行功能筛选，结果发现了与增殖和迁移有关的miRNA。本专利技术所提供的miRNA克隆自大鼠坐骨神经离断后的L4-6背根神经节和近端神经，成熟miRNA序列长度约为22nt，其前体序列具有miRNA前体典型的ニ级结构，符合miRNA的结构特征。本专利技术的目的是提供6种与神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸序列，以及该专利技术所涉及的miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸在制备神经损伤药物中的用途。本专利技术的具体技术方案如下 本专利技术所提供的与神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA序列如下1)mi RNA-SX I 5’ -AACAGGUGAUCUUCAAGUAGA-3 ’，染色体定位 xq21 ； 2)miRNA-sx2 5，-UGGGGGACAGGGCAAGGUGG-3，，染色体定位 lql2 ; 3 ) miRNA-sx3 5，-UGUGGGUAGAAUGACAGAGCAGA-3，，染色体定位 19p 11 ; 4)miRNA-sx4 5’ -AUGUAAGUGUGUAUGUAUAUG-3J,染色体定位 17ql2. 3 ； 5)miRNA-sx5 5，-UAGGCUAGAAAGAGGUUGGGGA-3，，染色体定位 lql2 ; 6 ) miRNA-sx6 5 ’ -UGAGGAUUACGAAGAGGAUGGU-3 ’，染色体定位 5q35。据此，本专利技术所提供的与神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA的前体RNA序列如下 1)5，-CAAUUCUGAAAACAGGUGAUCUUCAAGUAGAAAAAACACAAAAAAGGCA⑶UUUCUAUUUGAA⑶CAUCUCUUCUCCCUUUAA-3，；miRNA-sx2 前体 2)5，-GAGGCCA⑶UUGGGGGACAGGGCAAG⑶GGGCA⑶AGCUGACAGCCU GUUUACACUUGCCCUUUUUUCCCCAGGCUAUAGUUCGGUUGUGGCAGA-3，； miRNA-sx3 前体3)5，-CGGAAUUCACUGUGGGUAGAAUGACAGAGCAGACAGGAGACUAGAGAGUCUGCUUUGCCAUCUCUCUUGCAGGCA腳GCCU-3，； miRNA-sx4 前体4)5，-AUGUGUGUAUAUGUAAGUGUGUAUGUAUAUGUGUUUAUAUGAAUAUACAUAUACAUACUCACGCACACAUACACGCAA-3，； miRNA_sx5 前体5)5’-AUCGAUCCCCAUCCCAGCUUCCUUCCAGCCCUUGAUGUUUCAGUAUGCACAUAGGCUAGAAAGAGGUUGGGGAUGGGGAAAGA-3，；miRNA_sx6 前体6)5，-UAAAACGGAGUGAGGAUUACGAAGAGGAUGGUGUGGCUUUAAUAUUAGAACUUUACAGCAUCCUCUUCAUAAUCUUUACUCC⑶UUUAC-3，。据此，本专利技术所提供的与神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA的反义寡核苷酸序列如下 DmiRNA-sxl 反义寡核苷酸 5’ -UCUACUUGAAGAUCACCUGUU-3’ ； 2)miRNA-sx2反义寡核苷酸 5’ -CCACCUUGCCCUGUCCCCCA-3’ ； 3)miRNA-sx3反义寡核苷酸 5’ -UCUGCUCUGUCAUUCUACCCACA-3’ ； 4)miRNA-sx4反义寡核苷酸 5’ -CAUAUACAUACACACUUACAU-3’ ； 5)miRNA-sx5反义寡核苷酸 5’ -UCCCCAACCUCUUUCUAGCCUA-3’ ； 6 ) miRNA-sx6 反义寡核苷酸 5，-ACCAUCCUCUUCGUAAUCCUCA-3，。本专利技术提供的miRNA及其前体序列、反义寡核苷酸序列也可采用化学合成的方法得到；为增强其稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征，可对其进行硫代修饰或甲氧基修饰，也可采取两种方法结合修饰。本专利技术提供的miRNA及其前体序列、反义寡核苷酸序列可用于制备治疗周围神经损伤修复的药物。可以以其単独或混合形式为有效组分配制成非肠道给药制剂，依据给药模式、受害者的体征以适量剂量给药，也可采用基因治疗的方法，以治疗或病毒为表达载体，使其在周围神经损伤部位高效表达。附图说明图I为本专利技术所述的6个miRNA序列。图2为本专利技术所述的6个miRNA前体序列。图3为本专利技术所述的6个miRNA反义寡核苷酸序列。图4为本专利技术所述的6个miRNA RT-PCR电泳結果。图5为本专利技术所述的6个miRNA转染施万细胞后对施万细胞迁移的影响图示。图6为本专利技术所述的6个miRNA转染施万细胞后对施万细胞迁移的影响結果。 图7为本专利技术所述的6个miRNA转染施万细胞后对施万细胞増殖的影响图示。图8为本专利技术所述的6个miRNA转染施万细胞后对本文档来自技高网...

【技术保护点】
与神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA，具有如下核苷酸序列：1）miRNA？sx1？？？？5’？AACAGGUGAUCUUCAAGUAGA？3’，染色体定位xq21；2）miRNA？sx2？？？？5’？UGGGGGACAGGGCAAGGUGG？3’，染色体定位1q12；3）miRNA？sx3？？？？5’？UGUGGGUAGAAUGACAGAGCAGA？3’，染色体定位19p11；4）miRNA？sx4？？？？5’？AUGUAAGUGUGUAUGUAUAUG？3’，染色体定位17q12.3；5）miRNA？sx5？？？？5’？UAGGCUAGAAAGAGGUUGGGGA？3’，染色体定位1q12；6）miRNA？sx6？？？？5’？UGAGGAUUACGAAGAGGAUGGU？3’，染色体定位5q35。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：顾晓松，丁斐，于彬，李石营，周松林，钱天梅，顾芸，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：