本发明专利技术提供了一株具有高效降解邻苯二甲酸酯降解能力的菌株Arthrobacter?sp.ZJUTW及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC?NO：M?2012246，保藏日期：2012年6月24日。本发明专利技术提供了对邻苯二甲酸酯有较高降解能力的新菌株，并对其休止细胞降解DEP及DBP条件进行了优化，为有效解决邻苯二甲酸酯类化合物的环境污染问题提供可能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株邻苯二甲酸酯降解菌-节杆菌(Arthrobacter sp. )ZJUTW及其在微生物降解邻苯二甲酸酯中的应用。
技术介绍
邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalic acid esters,PAEs)是世界上广泛使用的人工合成难降解有机化合物，主要用于塑料增塑剂、涂料、油漆等化工生产中。美国国家环保局(EPA)1999年公布的129种优先污染物中包括了 6种PAEs类化合物，我国也已将其中的邻苯二甲酸二正辛酯(D0P)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)和邻苯二甲酸二甲酯(DMP)列为环境优先污染物。已有证据表明PAEs是一类环境内分泌干扰物，其最 明显的危害是使生殖机能下降，对动物及人类生殖系统有一定损害，可引起睾丸萎缩、精子减少以及生殖细胞超微结构改变。且对胚胎发育有一定毒作用。目前，PAEs在全球主要工业国的环境中已普遍检出。在土壤、河流、湖泊、海洋底质、饮用水、垃圾场乃至食品中都有检测到PAEs的存在。邻苯二甲酸酯类化合物在环境中的水解、光解速率非常缓慢，属于难降解物质。因此，微生物降解被认为是自然环境中PAEs完全矿化的主要过程。生长细胞受到外界化学或物理作用后会相应地发生变化，如基因表达、蛋白稳定性的变化等。而采用休止细胞则可以避免这种影响，利用微生物自身生长代谢产酶或诱导产酶的特点将微生物培养到对数生长末期，分离菌体并以一定的浓度悬于生理缓冲液中，此时微生物已经基本停止生长代谢，但保持酶的活性，其主要优点是反应专一性强，可以提高底物转化率，不易染杂菌，可以减少产物对菌体生长及酶合成的抑制。为了获得高效的邻苯二甲酸酯降解菌株，有效解决邻苯二甲酸酯类化合物的环境污染，专利技术人以DBP为模式化合物，从杭州河道污水出口的淤泥中分离出I株DBP降解菌Arthrobacter sp. ZJUTff,研究了其休止细胞对DBP与DEP的降解特性。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株具有降解邻苯二甲酸酯降解能力的菌株一节杆菌(Arthrobacter sp. ) ZJUTW,及其在微生物降解邻苯二甲酸酯中的应用。本专利技术采用的技术方案是一株邻苯二甲酸酯降解菌-节杆菌(Arthrobacter sp. ) ZJUTW,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No M2012246，保藏日期2012年6月24日。本专利技术还涉及所述的节杆菌ZJUTW在微生物降解邻苯二甲酸酯(PAEs)中的应用。所述邻苯二甲酸酯为下列之一邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)，其中以对DBP的降解能力为最优。所述降解在pH7 10、30 37°C下进行。本专利技术的有益效果主要体现在本专利技术筛选得到一株对邻苯二甲酸酯具有高效降解能力的菌株Arthrobacter sp. ZJUTW,该菌株可降解4种不同的PAEs,该菌株在休止细胞浓度为2 6X108cell/mL，pH7. 0，30°C，180rpm条件下，6h内可将118mg/L的DEP完全降解，8h内可将125mg/L的DBP完全降解，37 °C下的降解效率也无明显差异，休止细胞对118 1436mg/L的DEP表现出较高的降解能力，并可在20h内将浓度为1200mg/L的DBP完全降解，为有效解决邻苯二甲酸酯类化合物的环境污染问题提供可能。附图说明图I为为菌株ZJUTW的扫描电镜图片；图2为菌株ZJUTW不同生长时间形态图(X 1000) ；a.菌株ZJUTW生长4h的形态图；b.菌株ZJUTW生长24h的形态图；图3菌株ZJUTW的系统进化发育树；图4菌株ZJUTW对不同PAEs底物的降解；图5温度(a)及pH (b)对休止细胞降解DEP的影响；图6菌体浓度(a)及Tween-80对休止细胞(b)降解DEP的影响；图7不同底物浓度对休止细胞(a)及生长细胞(b)降解DEP的影响；图8温度对休止细胞降解DBP的影响；图9pH对休止细胞降解DBP的影响； 图10不同底物浓度对休止细胞降解DBP的影响。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此实施例I :I材料与方法I. I试剂与仪器DMP及DEP购于上海凌峰试剂有限公司，DBP购于浙江临平化工试剂厂，DEHP购于国药集团化学试剂有限公司，甲醇(色谱级，天津四友化工有限公司)，其余试剂均为分析纯。JEOL JEM-1230型透射电子显微镜(日本)，AgilentllOO高效液相色谱仪(美国)。1.2培养基基础无机盐培养基=K2HPO4· 3H20 I. Og/L, NaCl I. Og/L, (NH4)2SO4O. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 4g/L, CaCl2 0. 0755g/L, FeCl3 · 6H20 0. 0143g/L, pH7. 0。选择培养基每升无机盐培养基加适量DBP的甲醇溶液，使DBP终浓度为125mg/L0LB培养基蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水IOOOmL, pH 7. 0,121°C灭菌20minoI. 3 方法I. 3.1降解菌的筛选取杭州市河道污水出口处游泥Ig置于IOOmL水中，混匀，静置,然后取ImL加入到250mL选择培养基中，DBP初始质量浓度为125mg/L，30°C，180r/min培养4d，重复多次驯化。将有明显生长的培养液稀释涂布培养，同时测DBP降解情况，平板涂布法分离得到单菌落，观察菌落形态并挑取单菌落做进一步鉴定。1.3.2菌株对不同PAEs的降解将菌株接种到基础培养基中，接种量为2%，向培养基中加入DEP、DMP、DBP及DEHP，每种底物浓度均为50mg/L，将培养基置于30°C、180r/min的恒温摇床中振荡培养，不同时间测定各种底物的浓度，分析菌株对不同底物的降解能力。I. 3. 3休止细胞的制备将菌株接种到LB培养基，30°C，180r/min培养到对数末期，4000r/min离心收集细胞，用无菌水洗I次，沉淀悬浮于PH 7. O的O. lmol/L磷酸钾缓冲液中，加入少量葡萄糖，制成菌悬液，使其菌体浓度约为2飞X 108cell/mL。 I. 3. 4不同条件下休止细胞对DEP与DBP降解的影响通过改变温度、pH、底物浓度、休止细胞浓度及Tween-80等条件，考察不同降解条件下休止细胞对DEP与DBP降解的影响。I. 3. 5PAEs 检测方法取5mL培养液，置于具塞试管中，加入等体积石油醚，剧烈振荡，静置2. 5h，将上层有机相在旋转蒸发仪上蒸干后用ImL甲醇溶解，用HPLC Agilent 1100HPLC检测，检测条件Hypersil BDS C18色谱柱,流动相为甲醇H20=9O :10,流速I. OmL/min,进样量20 μ L,二极管阵列(DAD)检测器，检测波长235nm。2结果与分析2. I菌株的形态及生理生化特征将经多次驯化后的菌液稀释涂布，挑取形态不同的单菌落接入选择培养基进一步检测，其中菌株ZJUTW的降解效果最优。菌株ZJUTW在固体平板上形成的菌落为圆形，淡黄色，菌落表面光滑，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株邻苯二甲酸酯降解菌——节杆菌（Arthrobacter？sp.）ZJUTW，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC？No：M？2012246，保藏日期：2012年6月24日。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邱乐泉，陈阳，钟卫鸿，吴石金，李烜桢，钟莉，王子超，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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