一种具有良好热稳定性的脂肪酶微乳液的制备方法，包括如下步骤：1）将脂肪酶与聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）分别溶解在磷酸盐缓冲溶液中，所述PNIPAAm采用原子转移自由基聚合方法合成，将上述两种溶液以1:1的体积比均匀混合；2）将二（2-乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠（AOT）溶解在异辛烷中，在磁力搅拌下将脂肪酶与PNIPAAm的混合液缓慢滴入溶有AOT的异辛烷混合液中，形成稳定、透明、均一的微乳液。本发明专利技术的优点是：该制备方法通过在微乳液体系内加入温敏性聚合物可有效提高脂肪酶的热稳定性，温敏性聚合物PNIPAAm易于合成，成本较低；包裹有PNIPAAm和脂肪酶的微乳液光学透明热力学稳定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物酶
，特别是。
技术介绍
脂肪酶(lipase)是一种能够催化甘油酯类化合物水解的酶，存在于大多数生物体内，并且密切关系到生物体内脂类的消化、运输和加工。此外脂肪酶还具有界面活性，能在油水界面催化疏水性底物水解。这大大拓宽了传统酶促反应的使用范围，也丰富了脂肪酶的作用底物种类。所以随着生物酶技术的快速发展 ，脂肪酶得到了越来越多的关注，并被广泛应用于食品、造纸、日用化工、油脂化工等领域。然而很多脂肪酶相关的生产过程是在高温下进行的，甚至在一些储存和运输途中也需要保持高温，因此具有良好热稳定性的脂肪酶有着重要的应用价值和大量的实际需求。目前，提高脂肪酶的热稳定性的方法主要是将脂肪酶固定在各种载体例如多孔硅，凝胶等上。这种方法一般需要对载体进行预处理，操作较复杂，而且固定化效率有限。此外，其得到的固定化脂肪酶大部分都在水溶液体系中使用，并不适用于微乳液体系。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述存在问题，提供了，通过在微乳液中简单添加温敏性聚合物就可以在原位显著提高脂肪酶的热稳定性，而且复性后使用脂肪酶时无需去除添加剂，同时这种温敏性聚合物的添加不会影响到脂肪酶在微乳液中的界面活性。本专利技术的技术方案，包括如下步骤I)将脂肪酶与均聚物聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)分别溶解在缓冲溶液中得到脂肪酶溶液和PNIPAAm溶液，脂肪酶的浓度为O. 16mg/mL, PNIPAAm的浓度为3_15mg/mL，所述缓冲溶液为pH=7. 5、浓度IOmM的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，将上述两种溶液以1:1的体积比均匀混合；2)将表面活性剂二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠(AOT)溶解在异辛烷中得到混合液，AOT与异辛烷的质量比12. 9:100，在磁力搅拌下将脂肪酶溶液与PNIPAAm溶液的混合液缓慢滴入溶有AOT的异辛烷混合液中，形成稳定、透明、均一的微乳液，所述微乳液中Wtl值为 IO (W0= /)ο所述均聚物聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)采用原子转移自由基聚合(ATRP)方法合成，分子量为1470-4300Da (道尔顿)。该脂肪酶微乳液的热稳定性的检测方法I)将制备好的微乳液在热水浴中加热，然后在4°C条件下静置令脂肪酶复性；2)室温下将480 μ L脂肪酶微乳液与20 μ L溶有棕榈酸对硝基苯酯(ρ_ΝΡΡ)的异辛烷在比色皿中快速混合后，立即通过紫外可见分光光度计检测反应液在333nm处的吸光度变化，与未加热的微乳液中的脂肪酶相比，得到其相对酶活性。提高微乳液中的脂肪酶热稳定性的原理脂肪酶的热稳定性较差，经历高温后易失活，这主要是因为脂肪酶分子在高温时变性，致使酶分子之间发生不可逆的聚集，即使降温后也无法恢复到其原本的结构。在本专利技术中，温敏性聚合物PNIPAAm与脂肪酶分子共同存在于微乳液的水相液滴中，高温时PNIPAAm因其温度敏感的特性而变得疏水，能与变性脂肪酶相结合，从而防止与其它脂肪酶分子发生聚集。低温时，PNIPAAm变得亲水而自动释放脂肪酶，随后脂肪酶可以恢复到其天然结构，重新获得酶活性。此外，微乳液使得体系中的聚合物和酶分子被分隔在一个个微小的受限空间中，这样高温时聚合物自身不会形成大的聚集体而是形成具有高比表面积的纳米级颗粒，从而大大提高聚合物和酶分子之间的复合效率。 本专利技术的优点是该制备方法通过在微乳液体系内加入温敏性聚合物可有效提高脂肪酶的热稳定性，温敏性聚合物PNIPAAm易于合成，成本较低；包裹有PNIPAAm和脂肪酶的微乳液光学透明热力学稳定，同时可以利用脂肪酶在微乳液中的界面活性，实现脂肪酶的储存、遇热保护、复性、应用均在同一体系内直接完成，这将帮助脂肪酶获得更多更广泛的实际应用。附图说明图I为经过高温加热、复性后的微乳液中的脂肪酶在没有和有PNIPAAm存在时的相对活性对比图。图2为在37°C加热不同时间的微乳液中的脂肪酶在没有和有PNIPAAm存在时的相对活性对比图。具体实施例方式以下实施例仅用于进一步详细说明本专利技术而非用于限制本专利技术的范围。实施例，包括如下步骤I)将脂肪酶与PNIPAAm分别溶解在缓冲溶液中得到脂肪酶溶液和PNIPAAm溶液，脂肪酶的浓度为O. 16mg/mL, PNIPAAm的浓度为4. 32mg/mL,所述缓冲溶液为pH=7. 5、浓度IOmM的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，将上述两种溶液以I: I的体积比均匀混合，所述PNIPAAm系采用原子转移自由基聚合(ATRP)方法合成，分子量为1470或4300Da (道尔顿)，根据聚合度分别标示为PNIPAAm13和PNIPAAm38 ；2)将表面活性剂AOT溶解在异辛烷中得到混合液，AOT与异辛烷的质量比12. 9:100，在磁力搅拌下将脂肪酶溶液与PNIPAAm溶液的混合液缓慢滴入溶有AOT的异辛烷混合液中，形成稳定、透明、均一的微乳液，所述微乳液中Wtl值为KKWftHWVtAOT])。该脂肪酶微乳液的热稳定性的检测方法I)将制备好的微乳液在75°C水浴中加热30分钟，然后在4°C条件下静置令脂肪酶复性；2)室温下将480 μ L脂肪酶微乳液与20 μ L溶有棕榈酸对硝基苯酯(ρ_ΝΡΡ)的异辛烷在比色皿中快速混合后，立即通过紫外可见分光光度计检测反应液在333nm处的吸光度变化。与未加热的微乳液中的脂肪酶相比，得到其相对酶活性。图I为经过高温加热、复性后的微乳液中的脂肪酶在没有和有PNIPAAm存在时的相对活性对比图，所有样品中脂肪酶的浓度均相同。图中表明经历高温加热后，在没有PNIPAAm存在的微乳液中残余酶活性很低，而有PNIPAAm存在的微乳液中脂肪酶依然保持了较高活性。将该方法制备的脂肪酶微乳液置于37°C水浴中，分别于加热1、3、5、7天后取样检测酶活性。图2为在37°C加热不同时间的微乳液中的脂肪酶在没有和有PNIPAAm存在时的相对活性对比图，测试结果反映了脂肪酶在37°C储存较长时间时PNIPAAm的有无对其稳定性的影 响。可以发现有PNIPAAm伴随时，脂肪酶的稳定性得到了很大提高，七天后仍保持着较高的活性。权利要求1.，其特征在于包括如下步骤 1)将脂肪酶与聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)分别溶解在缓冲溶液中得到脂肪酶溶液和PNIPAAm溶液，脂肪酶的浓度为O. 16mg/mL, PNIPAAm的浓度为3_15mg/mL，所述缓冲溶液为pH=7. 5、浓度IOmM的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，将上述两种溶液以1:1的体积比均匀混合； 2)将表面活性剂二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠(AOT)溶解在异辛烷中得到混合液，AOT与异辛烷的质量比12. 9:100，在磁力搅拌下将脂肪酶溶液与PNIPAAm溶液的混合液缓慢滴入溶有AOT的异辛烷混合液中，形成稳定、透明、均一的微乳液，所述微乳液中Wtl值为10(Wq=/)。2.根据权利要求I所述具有良好热稳定性的脂肪酶微乳液的制备方法，其特征在于所述均聚物聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)采用原子转移自由基聚合(ATRP)方法合成，分子量为1470-4300Da (道尔顿)。全文摘要，包括如下步骤1)将脂肪酶与聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)分别溶解在磷酸盐缓冲溶液中，所述PNIPAAm本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有良好热稳定性的脂肪酶微乳液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1）将脂肪酶与聚N？异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）分别溶解在缓冲溶液中得到脂肪酶溶液和PNIPAAm溶液，脂肪酶的浓度为0.16mg/mL,PNIPAAm的浓度为3？15mg/mL，所述缓冲溶液为pH=7.5、浓度10mM的磷酸盐缓冲溶液（PBS），将上述两种溶液以1:1的体积比均匀混合；2）将表面活性剂二（2？乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠（AOT）溶解在异辛烷中得到混合液，AOT与异辛烷的质量比12.9:100，在磁力搅拌下将脂肪酶溶液与PNIPAAm溶液的混合液缓慢滴入溶有AOT的异辛烷混合液中，形成稳定、透明、均一的微乳液，所述微乳液中W0值为10(W0=[H2O]/[AOT])。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：史林启，陶倩，李昂，刘学，张珍坤，马如江，安英丽，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：
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