改进的细胞培养方法技术

本发明专利技术涉及用于在哺乳动物CHO细胞中产生多肽的细胞培养方法，其特征在于一次或多次温度变动和pH变动，就它们的时间选择和步长调整该变动，以减少细胞死亡、提高产物产率和改善产物质量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物技术的一般领域，尤其涉及细胞的培养及其在以工业规模生产多肽中的用途。本专利技术提供细胞培养方法，其特征在于至少一次温度变动和至少一次pH变动。这些方法适合用于培养具有高细胞存活率(viability)的细胞，优选如CHO细胞的哺乳动物细胞。在用于尤其是通过在哺乳动物细胞培养系统中重组表达多肽来尤其是以工业规模产生多肽时，本专利技术的细胞培养方法进一步允许获得高多肽生产力。
技术介绍
在过去二十年中，用重组技术制备多肽已发展为标准方法。通过克隆编码各多肽的基因、然后用该待表达的基因转化适宜的表达宿主、最后产生和纯化所获得的重组多肽 产物来获得重组多肽提供了一类全新的通过生物学设计和产生的药物。在重组DNA技术后使用生物工程领域中发展的产生方法，制药产业中已制备了数目越来越多的药物活性化合物。这类生物产物包括单克隆抗体，其已发展为包括自身免疫病、炎性障碍、免疫抑制、肿瘤学等的多种医学领域中重要的治疗选择。这类生物来源药物的发展需要以工业规模生产，从而提供大量重组多肽。优选的表达系统是哺乳动物细胞培养物，其优于大多数其他基于昆虫细胞、酵母等的真核系统，或甚至传统的原核表达系统。但是，尤其是在工业规模，哺乳动物细胞培养包括巨大的挑战。用于哺乳动物细胞培养的生产设施需要彻底优化许多方法条件。具体而言，用于在哺乳动物细胞中产生多肽的细胞培养方法需要持续优化培养条件及其对具体细胞系或产物的适应，以达到与最佳产物质量组合的高容积产物产率。之前的许多努力集中在细胞培养基的基本参数上，包括它们与例如离子、氨基酸、维生素或痕量元素的种类和浓度相关的组成，或培养基的重量摩尔渗透压浓度。处于研究焦点中的其他重要参数是例如达到最佳细胞生长的流加组合物或流加时间表。还已知温度和pH作为基本生理学参数对哺乳动物细胞的培养具有显著影响。一般而言，温度显著影响细胞的生长状态和存活率。但是，除此之外，它还可以更明确地通过改变例如糖基化来影响多肽产物及其特征(US 2003/0190710A1 ；EP 1373547A1 ；US2004/0214289A1)。生长培养基和细胞所维持在的pH也可以以依赖于具体细胞系和产物的具体方式来影响和改变细胞生长和多妝产生(Sauer等Biotechnology and Bioengineering 2000，67 卷，586-597 页；Yoon 等，Biotechnology and Bioengineering 2004, 89 卷，346-356 页；Kuwae 等，Journal of Bioscience and Bioengineering 2005,100 卷，502-510 页)。在培养时程中，细胞的需要可以改变。在开始时，针对改善的细胞生长优化条件是有利的，但在随后的阶段，与获得高产物效价相关的增强的细胞存活和活细胞密度的维持变得重要。在这方面，已提出在细胞培养过程中引入一个或多个温度梯度(Chen等，JBiosci Bioeng. 2004 ；97(4) :239-43)。为此，至少在两个不同温度下培养培养哺乳动物细胞，其中针对细胞生长优化第一个较高的温度，而选择第二或第三个较低的温度来改善细胞的生产力(例如 Weidemann 等，Cytotechnology. 1994 ; 15 (1-3) :111-6 ；W0 00/36092 ；EPO 764 719 A2 ；US 2005/019859 ；EP I 575 998 ；US 2008/081356)。其他文件描述了温度梯度与其他具体的培养基特征组合的用途。例如，EP I 757 700 A2公开了温度梯度与丁酸盐作为培养基成分存在的组合，而EP I 789 571 Al描述了温度梯度与确定的氨基酸含量组合。还改变了其他细胞培养条件。US 5 856 179介绍了用于在补料分批细胞培养中产生多肽的方法，其中，在培养过程中，培养基的重量摩尔渗透压浓度从主生长期中的约280-330m0sm显著改变至生产期期间的约400-600m0sm。WO 02/101019着眼于许多具体的培养基成分，如谷氨酰胺和葡萄糖浓度，包括温度和PH的改变。但是，发现高葡萄糖培养基中的pH变动对培养物具有负面影响，不建议在生长期或生产期期间降低pH。 W02006/026445公开了用于产生多肽的方法，其中细胞培养条件从一组培养条件变为第二组培养条件，且其中此改变与具体的培养基特征组合，该培养基特征与具体氨基酸的含量相关。条件的改变明确涉及温度变动。诸如PH或重量摩尔渗透压浓度的其他条件改变一般作为附加选择提到，但是，未指出具体的参数设置。鉴于以上挑战和现有不足，工业生物
中存在对改进的培养方法的持续需要，该培养方法允许以甚至更高的产率(即改善的比生产力和总体生产力)和提高的产物质量以工业规模产生重组多肽。多肽产生方法的具体技术目标是通过优化总体细胞培养方法的参数来维持高细胞存活率并最大化多肽的最终产率。专利技术概述本专利技术涉及在用于产生重组多肽的方法中组合温度变动和pH变动。适应重组细胞，尤其是CHO细胞的需要，这两个参数的具体组合导致提高细胞的生产力以及改善重组产生的多肽的产物质量。具体而言，本专利技术发现了基于一次或多次温度变动和PH变动的具体时间选择和安排的绝对和相对而言以及与该变动的具体量级有关的积极作用。根据本专利技术的一个方面，公开了用于产生重组多肽的方法，其包括在培养基中培养CHO细胞并表达该重组多肽，其中在该过程中改变温度和pH。具体而言，本专利技术的方法涉及至少一次温度变动和至少一次pH变动。在本专利技术的一个实施方案中，首先在第一温度下培养和维持细胞至少3天、备选地至少4天或至少5天，然后实施从第一个较高的温度至第二个较低的温度的变动。第二个较低的温度比第一温度低约1°C至约8°C。在本专利技术的另一备选实施方案中，温度变动在例如约2°C和约5°C之间，尤其是约4°C或约3.5°C。然后维持第二温度至少2天。可以维持第二温度直至收获。根据本专利技术的一个方面，第一温度优选在约33°C和约38°C之间的范围内，第二个温度优选在约30°C和约37°C之间的范围内。除温度变动外，pH也从第一 pH变至第二 pH。因此，本专利技术的方法包括至少一次pH变动。具体而言，在第一 PH值下培养细胞至少2天，然后使pH变动至第二 pH值，该第二 pH值比第一 pH低约O. 05至约I个pH单位,在该第二 pH下培养细胞至少I天、备选地至少2天。在一些实施方案中，将维持该第二 PH直至收获。第一 pH值优选在约pH 6. 8和约pH 7. 5之间的范围内。第二 pH值优选在约pH6. O和约pH 7. I之间的范围内。因此，本专利技术的一个实施方案是用于产生重组多肽的方法，其包括在包含至少一次温度变动和至少一次PH变动的条件下在培养基中培养CHO细胞，并表达该重组多肽其中-在第一温度下培养细胞至少3天，然后使温度变动至第二温度，该第二温度比第一温度低约1°C至约8°C，在该第二温度下维持细胞至少另外2天的时间； -在第一pH值下培养细胞至少2天，然后使pH变动至第二 pH值，该第二 pH值比第一 pH低约O. 05至约I个pH单位,在该第二 pH下培养细胞至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·E·约斯腾，C·莱斯特，J·施密特，
申请(专利权)人：诺瓦提斯公司，
类型：
国别省市：