本发明专利技术涉及一种用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法及应用，其是预先将兔源多克隆抗体包被在酶标板上再加入封闭液封闭后用铝箔袋真空包装，制备成一个标准试剂盒，能够实现ELISA快速检测方法的标准化，检测时将该试剂盒中加入样品中捕集的耐热菌抗原，再加入耐热菌鼠源多克隆抗体，形成抗体-抗原-抗体的双抗体复合物，与酶标抗体、底物工作液，使双抗体复合物上的酶催化底物，再通过酶标仪测定其分光光度值与阴性对照样品的cut?off值比较，从而判定其为阴性或阳性，进而实现一种耐热菌双抗体夹心ELISA检测方法，检测时间短，检测结果稳定，大大提高了检测效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品微生物检测领域，具体涉及到果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA快速检测所用的试剂盒的制备方法或应用。
技术介绍
耐热菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)在高温或不利环境中可以形成芽孢，具有很强的耐热性，能够耐受果汁加工中的巴氏杀菌过程以芽孢的形式存在于果汁中，是引起浓缩苹果汁变质的主要微生物之一，耐热菌超标也是苹果汁生产企业最急需解决的问题。·目前，生产企业多采用传统平板培养计数法检测耐热菌，平板培养计数法主要包括美国KFL方法(美国库克实验室法)和澳大利亚Berri公司方法。KFL方法主要是采用滤膜过滤，将耐热菌截留在滤膜上，再将滤膜置于培养基上培养计数，此法检测周期一般为4 5天，在实际生产中无法满足耐热菌的实时检测。也有用PCR法，即聚合酶链式反应法检测耐热菌，其具有快速、特异的优点，但该方法对设备、实验室条件及环境要求高，实验操作步骤较繁锁，且假阳性较难控制，限制了 PCR检测法的推广应用。为此专利技术人所在的课题组曾提出了耐热菌的ELISA快速检测方法，已申请了中国专利，专利申请号分别为200910022897. 7和201010249781. X，该方法具有特异性高，操作简便，重复性好等特点，检测限可满足苹果浓缩汁中耐热菌不超过I个/ IOmL的国际标准，操作过程可在20小时内完成，达到快速检测的效果。但是这种方法在实施耐热菌的ELISA检测时，首先要制备抗体，包被酶标板，检测时间较长。抗体和酶标板制备对检测结果的可靠性很关键，也是实现ELISA检测方法标准化的关键环节，如能将抗体和酶标板提前制备成试剂盒，成为进一步研究的重要课题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题在于克服现有技术中的耐热菌的ELISA检测方法所存在的不足，提供了一种能抗体和酶标板提前制备成试剂盒，操作简单，能够实现ELISA检测方法标准化的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法。本专利技术所要解决的另一个技术问题在于提供利用上述的制备方法所制备的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的新的检测方法。本专利技术解决技术问题的技术方案是用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法包括以下步骤(I)耐热菌兔源多克隆抗体包被酶标板用浓度为0. 05mol / L、pH值为9. 6的碳酸缓冲液将耐热菌兔源多克隆抗体溶液稀释至浓度为4. 8 5. 2 ii g / mL,加入酶标板孔内，每孔加100 u L,置于恒温培养箱37°C孵育I. 9 2. I小时，将吐温-20与浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为I : 1900 2200混合配制成洗液，用洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干酶标板；(2)封闭酶标板向步骤(I)拍干的酶标板的每个孔内加入IOOy L的封闭液，置于恒温箱中37°C保温封闭90 150分钟，取出，用步骤(I)配制的洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干，得到封闭的酶标板；(3)试剂盒包装 将封闭的酶标板用铝箔袋真空包装，得到耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒；上述的封闭液是质量分数为1% 5%的明胶溶液或质量分数为1% 5%的牛血清蛋白溶液或质量分数为0. 1% 0. 5%的脱脂奶溶液。上述封闭液是质量分数为3. 8% 4. 2%的明胶溶液。利用上述制备的试剂盒进行果汁中的耐热菌的双抗体夹心ELISA检测方法，包括以下步骤(I)将经过灭菌处理的果汁样品作为阴性样品与待测果汁样品按照每孔IOOy L的量分别加入上述制备的试剂盒的酶标板孔中，置于恒温箱中37°C保温50 150分钟后取出，将吐温-20与浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为I :1900 2200混合配制成洗液，用洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干酶标板；(2)将浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 3mg / mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为I :190 220混合，加入步骤(I)的拍干后的酶标板中，每孔IOOii L，置于恒温箱中37°C孵育50 150分钟后取出，用步骤(I)中配制的洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干酶标板；(3)将浓度为0. 01mol/L、pH值为7. 6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照体积比为I :2500 11000混合，加入步骤(2)拍干的酶标板板孔中，每孔IOOy L，将其置于恒温箱中37°C孵育50 120分钟后取出，用步骤(I)配制的洗液冲洗酶标板2 3分钟，重复冲洗3 5次，拍干酶标板；(4)向步骤(3)的拍干后的酶标板板孔内加入底物工作液，每孔IOOii L，在恒温箱中37°C避光反应15 20分钟，加入50 u L浓度为2mol / L的硫酸溶液终止反应；(5)用酶标仪在450nm波长下测定步骤(4)反应终止酶标板的分光光度值，与步骤(I)的阴性样品的cut off值进行比较，确定待测果汁样品中耐热菌的存在，样品分光光度值大于cut off值，为阳性，表明样品中存在耐热菌，样品分光光度值小于cut off值，为阴性，表明样品中无耐热菌，cut off值按下式计算Cutoff = X+2xSD式中文表示阴性样品OD45tl的平均值，SD表示阴性样品OD45tl的标准差，OD45tl是波长为450nm下的分光光度值。上述步骤(2)中将浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 3mg / mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照较佳体积比为I :195 210混合,加入步骤(I)的拍干后的酶标板中。上述步骤(3)中将浓度为0. Olmol / L、pH值为7. 6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0. 8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照较佳体积比为I :3000 6000混合，加入步骤(2)拍干的酶标板板孔中。上述步骤(4)中的底物工作液的配制方法为取浓度为0. 2mol / L的磷酸盐缓冲溶液和浓度为0. Imol / L的柠檬酸溶液与二蒸水混合，二蒸水与磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸溶液的体积比为I :0. 514 :0. 486，配制成底物缓冲液；再将固液比为0. OOlg / mL的3，3-,5, 5’-四甲基联苯胺乙醇溶液与底物缓冲液以体积比为I :1混合，配制成混合溶液，加入质量分数为30%的H2O2溶液，混合溶液与H2O2溶液的体积比为I :0. 002，摇匀，即配制成底物工作液。上述的兔源多克隆抗体制备采用王峰，李建科等人报道的《苹果浓缩汁中嗜酸耐 热菌多克隆抗体的制备及纯化》(食品与发酵工业，2009年第35卷第4期，33-36页)的方法。上述的鼠源多克隆抗体采用名称为《耐热菌鼠源多克隆抗体制备》，专利申请号为201110427711. 3的中国专利所公开的制备方法制备。本专利技术预先将兔源多克隆抗体包被在酶标板上再加入封闭液封闭后用铝箔袋真空包装，制备成一个标准试剂盒，将抗体和酶标板提前制备好，制备方法简单，能够实现ELISA快速检测方法的标准化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）耐热菌兔源多克隆抗体包被酶标板用浓度为0.05mol／L、pH值为9.6的碳酸缓冲液将耐热菌兔源多克隆抗体溶液稀释至浓度为4.8～5.2μg／mL，加入酶标板孔内，每孔加100μL，置于恒温培养箱37℃孵育1.9～2.1小时，将吐温？20与浓度为0.01mol／L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为1：1900～2200混合配制成洗液，用洗液冲洗酶标板2～3分钟，重复冲洗3～5次，拍干酶标板；（2）封闭酶标板向步骤（1）拍干的酶标板的每个孔内加入100μL的封闭液，置于恒温箱中37℃保温封闭90～150分钟，取出，用步骤（1）配制的洗液冲洗酶标板2～3分钟，重复冲洗3～5次，拍干，得到封闭的酶标板；（3）试剂盒包装将封闭的酶标板用铝箔袋真空包装，得到耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒；上述的封闭液是质量分数为1%～5%的明胶溶液或质量分数为1%～5%的牛血清蛋白溶液或质量分数为0.1%～0.5%的脱脂奶溶液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李建科，夏凯，黄瑞蕊，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。