本发明专利技术公布了一种猪ROSA26特异性整合位点及其应用，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所述，通过其衍生的打靶载体系列如SEQ?ID?NO.1所示。本发明专利技术采用的ROSA26特异性位点在猪或高等哺乳动物基因组中不会受到免疫介导的排斥和表观遗传修饰，能介导外源基因稳定高效的表达。提供的ROSA26特异性位点打靶载体可以高效特异的实现打靶。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种猪R0SA26特异性整合位点，属于遗传工程领域。
技术介绍
近十年来，转基因技术得到迅猛的发展和广泛的应用，其与克隆技术的结合使转基因动物的生产从基础研究向产业化迈进成为可能，而转基因动物产业化成功的关键就在于使外源基因在转基因动物中稳定、高效和广泛的表达，目前研究表明，这主要与外源基因在宿主基因组中的整合位点相关，因此，获得到能使外源基因高效整合和稳定表达的整合位点是十分重要的。在小鼠中，现已证明，R0SA26位点无论是在各个胚胎发育时期还是在成体各种组织器官中，即几乎所有的细胞中都能广泛且高效的介导外源基因表达，而且目前已有多个 R0SA26 转基因小鼠品系(Zambrowicz BP, ImamotoA, Fiering S, et al. (1997)Disruptionof overlapping transcripts in the ROSA beta geo 26 gene trap strain leads towidespread expression of beta—galactosidase in mouse embryos and hematopoieticcells.Proc Natl Acad Sci USA,94(8) :3789-3794 ；Kisseberth WC,Brettingen NT,LohseJK, et al. (1999)Ubiquitous expression of marker transgenes in mice and rats.Dev Biol,214(1) =128-138) 此外，最近人R0SA26也已成功克隆，并也验证了其能介导外源基因在各种细胞类型中表达的广泛性(Stefan Irion, Herve Luche, Paul Gadue, etal. (2007)Identification and targeting of the R0SA26 locus in human embryonicstem cells. Nat Biotechnol, 25 :1477-1482)。虽然R0SA26位点在转基因小鼠中得到广泛应用，但在转基因大家畜中还未见报道。目前，转基因大家畜的生产主要采用随机整合的方法，即外源基因随机整合在宿主基因组的一个或多个不确定的位点中，这种方法容易导致宿主重要功能基因失活，并且外源基因容易受到免疫介导的排斥和表观遗传修饰，导致表达沉默，不利于外源基因在转基因猪中稳定、高效和广泛的表达。另外，拷贝数和整合位点的不确定也不利于转基因动物的鉴定，困扰着转基因技术向产业化迈进。有研究表明，同源重组技术介导的基因定点打靶将会克服上述问题。当前，除了小鼠以外，很少见基因打靶获得的转基因大家畜，在转基因猪中更未见相关报道，这主要是由于缺少理想的外源基因整合位点。所以本专利技术对猪R0SA26位点进行鉴定与应用，这对转基因猪的生产和研究具有实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供猪R0SA26特异性介导位点，用以解决转基因猪外源基因表达的不稳定性以及位置效应的不可预知性。本专利技术提供的猪R0SA26特异性整合位点，其DNA序列如以下I)或2)或3)所示I)其DNA序列为SEQ ID NO. I所示核苷酸序列；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列能够杂交且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列；3)与I)或2)限定的DNA序列具有95%以上同源性，且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种R0SA26特异性位点打靶载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本专利技术所要解决的另一个技 术问题是提供一种将猪R0SA26特异性介导位点在猪转基因中的应用。所述启动子的应用，其特征在于用于猪外源基因或内源基因的稳定表达。本专利技术采用的R0SA26特异性位点在猪或高等哺乳动物基因组中不会受到免疫介导的排斥和表观遗传修饰，能介导外源基因稳定高效的表达。提供的R0SA26特异性位点打靶载体可以高效特异的实现打靶。附图说明图15’同源臂的克隆与鉴定A =PCR获得的5，同源臂(I. 4kb) ；B =DNAman的同源比对结果。图23’同源臂的克隆与鉴定PCR 获得的 3 ‘同源臂(3. 6kb)。图3载体构建和基因打靶图4Southern blot鉴定结果GFP基因在猪R0SA26位点中的表达。图5Western blot 结果图6GFP基因在猪R0SA26位点中的表达。DC :猪成纤维细胞；1C :一细胞期克隆胚胎；2C :二细胞期克隆胚胎；4/8C :4_8细胞期克隆胚胎；M/B :桑葚胚和囊胚。图7绿色荧光蛋白转基因克隆囊胚。A :光镜照片；B :灭光照片；C :合成图片。具体实施例方式实施例I猪R0SA26特异性整合位点猪R0SA26特异性整合位点序列如SEQ ID NO. I所示，或在严格条件下(Tm-IO 15°C)与SEQ ID NO. I限定的DNA序列能够杂交且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列，或与SEQ ID NO. I限定的DNA序列高于90%同源性且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列。实施例2猪R0SA26特异性整合位点的获得根据gap两侧已有序列设计PCR引物，序列为5’ -GGATCTAATTGGAGCTATAACTGCCAGC-3， (forward)5， -GCTGAGGGTCCCAAATGCTTTG-3， (reverse)；PCR 条件为94 V 3min ；94 V 30sec，60 V 30sec，72 V Imin (30cycles)；72°C IOmin ；4°C lh。Rosa26位点位于猪第13号染色体,NCBI SscrofalO. 2 database已给出大部分序列信息，但第一内含子3 ‘端缺少108bp，据此，本实验在缺少的序列两侧，根据已有的序列信息设计引物，通过PCR得到缺少的序列信息，获得了猪Rosa26基因的启动子，第一外显子，第一内含子和第二外显子的全部序列，针对这些序列申请专利，保护其介导外源或内源基因的表达，其特征在于其DNA序列。如下 实施例3基于猪R0SA26特异性整合位点的打靶载体基于猪R0SA26特异性整合位点的打靶载体(图3)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。其构建方法为以PPNT6(公司addgene，货号11072)为骨架，构建猪R0SA26打靶载体。PCR克隆R0SA265 ‘和3，同源臂，大小分别为I. 4kb和3. 6kb，扩增引物为 5 ‘同源臂，5，-CGGGAGTGCGGCCCGCCCTGCGGC-3 ’ (forward)5， -AGTAGATCCGTGCTTTTTAACCTATC-3’ (reverse)；3’ 同源臂，5’ -GAGTTTTACAGTCATCCCATTTGTAGACTTTTGC-3’ (forward)5， -AGCTCTGATCCCGTGT TGTTGTGGCATAG-3’ (reverse) 在NotI和KpnI酶切位点处连入5 ‘同源臂，在XhoI和NheI酶切位点处连入3 ‘同源臂。然后，将pR26，CMV和EFla启本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪ROSA26特异性整合位点，其特征在于其DNA序列如以下1)或2)或3)所示：1)其DNA序列为SEQ？ID？NO.1所示核苷酸序列；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列能够杂交且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列；3)与1)或2)限定的DNA序列具有95％以上同源性，且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孔庆然，武美玲，刘忠华，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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