本发明专利技术涉及一种生产治疗糖尿病及血栓并发症的双功能药物(rolGLP-HV)工程菌的构建、制备方法和应用技术。将对2型糖尿病具有“治标治本”疗效的长效促胰岛素rolGLP-1与有效防治其心脑血管并发症的水蛭素rHV1融合，使其具有预防和治疗糖尿病及血栓并发症的双重功能。具体来说，应用基因工程技术获得rolGLP-1和rHV1的融合基因rolGLP-HV，并将其克隆到大肠杆菌表达载体pET22b(+)，构建表达载体pNK-EC-rolGLP-HV，转化大肠杆菌，获得高表达rolGLP-HV的工程菌NK-rolGLP-HV-E007。该菌株通过诱导表达和纯化可获得高纯度rolGLP-HV。胡氏血栓模型小鼠灌胃rolGLP-HV，可显著减缓其尾部血栓出现的时间和程度；糖尿病模型小鼠灌胃rolGLP-HV，可明显降低血糖水平并改善糖尿病症状，因此，本发明专利技术可用于开发同时治疗糖尿病及其血栓并发症的双功能药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种rolGLP_HV(长效促胰岛素-水蛭素)工程菌的构建方法及应用技术，属于生物制药
技术介绍
糖尿病(diabetes mellitus)是胰岛素绝对或相对分泌不足以及机体对胰岛素敏感性降低所引起的代谢紊乱，其主要临床特点是血糖高、糖尿、多尿、多饮、多食、消瘦、疲乏等，是最常见的慢性病之一。目前，随着人们生活水平的提高，人口老龄化以及肥胖发生率的增加，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势，并有向低龄化发展的趋向。据统计，中国已确诊的糖尿病患者达4000万，并以每年100万的速度递增，预计到2025年将达到6000万。 如今，糖尿病被许多学者说成是“百病之源”，是因为若糖尿病得不到有效的治疗，会引起多种并发症。糖尿病的并发症可达百种以上，主要有肠胃功能紊乱(大便干稀不定)、眼病(视力模糊，眼底出血，视网膜病变及脱落，白内障等)、脑血管病(脑动脉硬化，脑出血，脑血栓，失眠)、心血管病(冠心病，心律不齐，心跳过速等)、肾病(尿蛋白，肾炎，肾蟀，尿毒症等)等等。据世界卫生组织统计，糖尿病患者死亡率最高的为心脑血管病变，占50%，糖尿病人患脑血栓的发病率为非糖尿病人的12倍。因此，寻找一种治疗糖尿病同时又能有效预防和治疗其严重的并发症特别是心脑血管疾病的治疗方法或药物至关重要。胰高血糖素样肽-I (glucagon-like peptide-1,GLP-1),由胰升糖素原衍生而来，为30个氨基酸的多肽，大量研究证实GLP-I能刺激胰岛素分泌，且血糖越高，GLP-I的促胰岛素作用越强；如果血糖浓度恢复至正常值时，GLP-I就不会再继续作用，因而不会产生低血糖现象，被称为聪明的降糖药物；GLP-1还能减少胰岛细胞损伤，改善胰岛细胞结构，修复胰岛β细胞功能，促进胰岛β细胞再生，提高胰岛细胞活力并延长其寿命，抑制胰升糖素的释放，调控胰腺β细胞特异基因表达并通过这种基因调控改善葡萄糖转运和代谢，提高β细胞对葡萄糖的反应性以及降低食欲和抑制胃的排空等功能(Gastroenterology,2002,122 :531-544, Endocr Rev, 1995,16 :390-410, Curr Diab Rep, 2003, 3 :365-372,Diabetologia, 1992, 35 :701-711, Digestion, 1994, 55 :22-28, Endocrinol,1992,130 159-166, Euro J Endocrinol,2000,143 :717-725, J Clin Invest,1993,91 :301-307,Diabetes, 1989，38 :902-909, J Clin Invest, 2000，105 :955-965, Diabetes,1999，48 2270-2276,Gastroenterology, 1994，107 :1948-1955)。GLP-1 被认为是可从根本上治疗糖尿病的一种“治标治本”的药物，对于糖尿病的治疗具有重要意义。水蛭素(Hirudin, HV)是从医蛭(Hirudomedieinalis)唾液腺中分离提纯的一类酸性小分子蛋白质，一般由65-66个氨基酸组成，有很多酸性氨基酸。水蛭素的分子量大约在7kDa左右。水蛭素是目前最好的凝血酶抑制剂，对于治疗和预防弥散性血管内凝结(DIC)、心及脑血管栓塞具有很大的应用价值。水蛭素能够阻止凝血酶对纤维蛋白原的作用，起到凝血作用，同时又能抑制血小板凝集，加速血栓溶解，降低血液黏稠度，对心脑血管疾病患者因血液流变性异常而出现的浓、黏、聚状态有较好的改善作用；水蛭素能明显降低血脂，调节血浆中的PGI和TXB的相对平衡，维持血管内环境的稳态，从而起到预防动脉粥样硬化和高血脂的功效，是治疗心脑血管疾病的首选良药(Biomed Biochim Acta, 1985,44 :1007-1013，Biochem. J. 1994，300 :643-650, Thromb Rest,2003,109 :S17_S22，JPharSci,2000,89(5) :579-585, Thromb Res, 2002,106 V275-V284, Semin Thromb Hemost,2001,27(5) :543-9, Circulation,2001,103 :1479-1484, N Engl J Med，1995，332(20)1330-1335)。在预防和治疗糖尿病过程中，关注其并发症特别是血栓的预防和治疗十分必要。因此，本专利技术将rolGLP-Ι基因和IflV1基因通过平端连接进行融合，使其在大肠杆菌中高效表达，纯化获得的rolGLP-HV 口服后可被胃肠道中的胰蛋白酶切成两种功能性药物，起到治疗糖尿病及其血栓并发症的双重功能，为治疗糖尿病及心脑血管疾病提供一种新的方法和药物。经文献检索，目前国内外尚无将rolGLP-Ι和讯^两种基因融合表达以及rolGLP-HV大肠杆菌工程菌的报道
技术实现思路
·本专利技术的目的是I)构建一种含有rolGLP-Ι和！HV1编码序列的融合基因rolGLP-HV。2)构建一种含有roIGLP-HV融合基因的载体pNK-EC-rolGLP_HV和高表达roIGLP-HV 的大肠杆菌工程菌 NK-rolGLP-HV_E007。3) NK-rolGLP-HV-E007诱导表达，可获得糖尿病与血栓双功能口服药物roIGLP-HV。4)纯化的roIGLP-HV可进行糖尿病及血栓并发症的治疗。本专利技术是通过以下技术方案实现的首先，本专利技术提供了一种融合基因rolGLP-HV，该基因包含一段胰高血糖素样多肽-I基因rolGLP-Ι和一段水蛭素基因！HV1，其基因序列如图I所示。在本专利技术提供的融合基因rolGLP-HV中，所述的胰高血糖素样多肽-I基因GLP-1，其基因内的二肽酶IV和胰蛋白酶识别位点已被去除，第8位的Ala被Ser取代，第26位和34位的Lys分别被Gln和Asp取代；所述的水蛭素基因是水蛭素变异体_1基因！HV1 ；rolGLP-Ι基因和IflV1基因直接首尾串联连接，获得融合基因rolGLP-HV。利用rolGLP-1的C端最后氨基酸为Arg(恰好为胰蛋白酶的识别位点)的特点，进而保证其表达产物!■olGLP-HV在体内可被胰蛋白酶切割成具有完整N端的ioIGLP-1和!HV1单体而发挥作用。融合基因rolGLP-HV的构建过程通过对合成的寡核苷酸片段磷酸化处理、Pfu补平、T4连接酶连接获得!HV1基因；通过PCR获得rolGLP-Ι基因。通过平端直接连接的方法将二者融合，获得rolGLP-HV融合基因。将其克隆到pMD18T-Simple载体，获得pMD18T-Simple-rolGLP_HV，该载体即包含本专利技术图I所示的融合基因rolGLP-HV的基因序列。其次，本专利技术提供了一种大肠表达载体，该表达载体包含以上所述的融合基因rolGLP-HV，具体是指大肠杆菌表达载体——pNK-EC-ro IGLP-HV。其构建过程如下将上述得到的克隆载体pMD18T-Simple-rolGLP-HV中的融合基因rolGLP-HV进行PCR扩增，得到的融合基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种rolGLP？HV融合基因，该融合基因包含长效胰高血糖素？1(rolGLP？1)基因和水蛭素rHV1基因，其DNA碱基序列为：？？？？？？？？10？？？？？？？？？20？？？？？？？？？30？？？？？？？？？40？？？？？？？？？50？？？？？？？？？60？？？？？？？？？70？？？？？？？？？80CATTCTGAGG？GTACTTTCAC？TTCTGATGTT？TCCTCCTACT？TGGAGGGTCA？GGCTGCTCAA？GAGTTCATCG？CTTGGTTGGTGTAAGACTCC？CATGAAAGTG？AAGACTACAA？AGGAGGATGA？ACCTCCCAGT？CCGACGAGTT？CTCAAGTAGC？GAACCAACCA？？？？？？？？90？？？？？？？？100？？？？？？？？110？？？？？？？？120？？？？？？？？130？？？？？？？？140？？？？？？？？150？？？？？？？？160TGATGGTAGA？GTTGTCTACA？CTGACTGTAC？TGAATCTGGT？CAAAACTTGT？GTTTGTGTGA？AGGTTCCAAC？GTTTGTGGTCACTACCATCT？CAACAGATGT？GACTGACATG？ACTTAGACCA？GTTTTGAACA？CAAACACACT？TCCAAGGTTG？CAAACACCAG？？？？？？？170？？？？？？？？180？？？？？？？？190？？？？？？？？200？？？？？？？？210？？？？？？？？220？？？？？？？？230？？？？？？？？240AAGGTAACAA？GTGTATCTTG？GGTTCTGACG？GTGAGAAGAA？CCAATGTGTT？ACTGGTGAGG？GTACTCCTAA？GCCACAATCCTTCCATTGTT？CACATAGAAC？CCAAGACTGC？CACTCTTCTT？GGTTACACAA？TGACCACTCC？CATGAGGATT？CGGTGTTAGG？？？？？？？250？？？？？？？？260？？？？？？？？270？？？？？？？？280？？？？？？？？290？？？？？？？？300？？？？？？？？310？？？？？？？？320CATAACGACG？GTGACTTCGA？GGAGATTCCA？GAGGAATACT？TGCAAGTATTGCTGC？CACTGAAGCT？CCTCTAAGGT？CTCCTTATGA？ACGTT编码的氨基酸序列为：[His？Ser？Glu？Gly？Thr？Phe？The？Ser？Asp？Val？Ser？Ser？Tyr？Leu？Glu？Gly？Gln？Ala？Ala？Gln？Glu？Phe？Ile？Ala？Trp？Leu？Val？Asp？Gly？Arg？Val？Val？Tyr？Thr？Asp？Cys？Thr？Glu？Ser？Gly？Gln？Asn？Leu？Lys？Leu？Cys？Glu？Gly？Ser？Asn？Val？Cys？Gly？Gln？Gly？Asn？Lys？Cys？Ile？Leu？Gly？Ser？Asp？Gly？Glu？Lys？Asn？Gln？Cys？Val？Thr？Gly？Glu？Gly？Thr？Pro？Lys？Pro？Gln？Ser？His？Asn？Asp？Gly？Asp？Phe？Glu？Glu？Ile？Pro？Glu？GLu？Tyr？Leu？Gln]...
【技术特征摘要】
1.一种rolGLP-HV融合基因，该融合基因包含长效胰高血糖素-l(rolGLP-l)基因和水蛭素rHVl基因,其DNA碱基序列为 1020304050607080 CAHCTGAGG GTACITTCAC πΟ Α ΓΤ TOCTOCTACT TGGAGGGTCA GGCTGCTCM GAGTTCATOG CTTGGTTGGT GTMGACTOC CATGAMGTG MGACTACM AGGAGGATGA A0CT00CAGT OOGAOGAGn CTCMGTAGC GMOCMOCA 90 100110120130140150 160 TGATGGTAGA GTTGTCTACA CTGACTGTAC TGMTCTGGT CAAMCTTGT GTTTGTGTGA AGCTTOCMC GTTTGTGGTC ACTA0CATCT CMCAGATGT GACTGACATG ACTTAGAOCA GTTTTGMCA CAMCACACT TOCMGGTTG CAMCAOCAG 170 180190200210220230 240MGGTMCM GTGTATCTTG GCTTCTGAOG GTGAGMGM OCMTGTGH ACTGGTGAGG GTACTOCTM GCCACMTOCποοΑτταπ cacatagmc ocmgactgc cactcttctt gghacacm tgaocactoc catgaggah oggiuttagg 250 260270280290300310320CATAACGACG GTGACTTCGA GGAGATTCCA GAGGAATACT TGCAAGTATTGCTGC CACTGAAGCT CCTCTAAGGT CTCCTTATGA ACGTT编码的氨基酸序列为[His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-The-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Asp-Gly-Arg-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Ly...
【专利技术属性】
技术研发人员：李明刚，卫一鸣，王维婧，马百成，胡晓宇，张耀方，乔坤艳，李宠，马志华，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：
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