改进的从磁性玻璃颗粒中的核酸回收制造技术

本发明专利技术是一种使用能够结合核酸的固相，例如磁性玻璃颗粒分离核酸的方法，其中通过乙烯胺化合物的存在增强核酸与固相的结合。本发明专利技术还包括用于分离核酸的包含乙烯胺化合物的反应混合物和用于实施所述方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的从磁性玻璃颗粒中的核酸回收专利
本专利技术涉及分离核酸的领域，和具体地使用固体支持物分离核酸的领域。技术背景分离核酸是分子诊断学中的重要步骤。从样品中分离的核酸的质量和数量大大影响了下游诊断应用的成功。临床和野外应用也要求分离程序迅速且能够自动化。存在很多程序用于从多种生物和组织中分离核酸。一些类型的临床和环境样品对核酸的成功分离提出了特别的挑战。例如，某些组织例如骨含有在可以评估核酸以前需要去除的大量细胞外材料。一些生物，例如真菌、植物和细菌具有需要剧烈化学处理的细胞壁或外膜。在剧烈处理中使用的试剂对利用分离的核酸的下游应用造成挑战。此外，在剧烈处理期间的靶核酸的降解可导致下游检测测定中的假阴性结果。但是为了临床上可接受的，诊断程序必须具有足够的灵敏度，即避免在患者样品中的假阴性结果。因此在分子诊断学领域中，需要改进分离核酸的方法，从而使诊断程序灵敏、可信和易于操作。成功的基于核酸的诊断试验的先决条件是分离没有降解的、无抑制剂的核酸。同时，需要简单、易于自动化的核酸分离程序。最近开始流行使用固体支持物，例如球形微粒分离核酸。特别流行的是含有或覆盖玻璃样物质的磁性微粒，通常被称为“磁性玻璃颗粒”或“MGP”。使用MGP的核酸分离程序需要相对少的步骤和易于自动化。特别流行的是通过在欧洲公开EP I 154 443或美国专利6，255，477和6，870，047中描述的溶胶-凝胶法(sol-gel)制备的 MGP。通过溶胶-凝胶法制备的MGP的一般描述和具体实例可在文献中容易地获得(见例如EP I 154 443)。这些MGP由覆盖基于二氧化硅的玻璃样材料的铁磁核心组成。铁磁核心一般包含铁氧化物，例如Fe3O4或Fe203。核心可为简单的铁核心，或可由复合材料组成。核心也可由结晶的、陶瓷或玻璃样结构组成，其中包埋氧化铁。玻璃涂层可由含氧化硅的无定形材料组成，并可还包含一种或多种另外的金属氧化物例如氧化硼(B2O3)，氧化招(Al2O3),氧化韩(CaO),氧化钡(BaO),氧化钾(K2O),氧化钠(Na2O),氧化酶(MgO)或氧化铅(Pb2O3)。在一些实施方案中，玻璃是硅氧化物并也包含在以下浓度范围中的一种或多种化合物=B2O3 (0-30%)，Al2O3 (0-20%)，CaO (0-20%)，BaO (0-10%)，K2O (0-20%)，Na2O(0-20%)，MgO (0-18%) ,Pb2O3 (0-15%)。玻璃可也包含小百分比(0_5%)的若干其他氧化物例如Mn2O3, TiO2, As2O3, Fe2O3, CuO和CoO。 已证明，由硼硅玻璃组合物组成的表面特别有效。硼硅玻璃具有超过25%的氧化硼含量，例如70/30的Si02/B203组成。有时候用便于核酸结合的官能团修饰磁性颗粒。这样的基团包括(不限于)用于捕获含多聚A的核酸的多聚T寡核苷酸，用于捕获生物素标记的核酸的链霉抗生物素，和用于捕获包含与探针互补的唯一序列的核酸的特定探针序列。但是，最常用的是具有未修饰表面的磁性颗粒，其能够分离在样品中存在的任意核酸，不管其序列。使用MGP的一般的核酸分离方案从破坏细胞或组织以释放核酸开始。通常使用的组织破坏程序是化学、酶或物理性质的，包括超声、高压、剪切力、强碱、去垢剂或离液剂、蛋白酶或脂酶。用于化学和酶裂解，裂解试剂一般包括缓冲剂、盐、一种或多种变性物质和离液物质、蛋白酶和任选地核酸酶抑制剂和防腐剂。裂解试剂导致蛋白质的降解，核酸酶的抑制和脂、脂蛋白等的增溶。例如，缓冲剂可为Tris，盐可为钠、钾、铵或镁盐，例如氯化物或醋酸盐，去垢剂可为十二烷基硫酸钠、Triton-X或Tween，离液剂可为尿素、硫脲、亚碘酸钠、十二烷基硫酸钠、高氯酸钠、硫氰酸胍、异硫氰酸胍或亚氯酸胍，核酸酶抑制剂可为螯合剂例如EDTA，防腐剂可为金属叠氮化物，和蛋白酶可为蛋白酶K。通常，在70至100 C之间的温度，例如，90对大多数样品，上面描述的裂解试剂和条件足以获得细胞的裂解和将核酸释放到溶液中。不幸的是，对一些样品类型，裂解造成了主要挑战。一些细胞、生物和组织需要剧烈的裂解条件以破坏细胞壁或组织和释放细胞内含物。例如，革兰氏阳性病原体例如结核分支杆菌iMercwAxsis)具有富含脂类的肽聚糖细胞壁。检测结核分支杆菌和其他分支杆菌的快速方法是世界范围内的需要。然而，核酸分离经常是达到测定灵敏度期望水平的限制因素。见Neonakis等人(2008) Molecular diagnostic tools inmycobacteriology, J. Microbiol. Methods, 75:111 目前，在分支杆菌检测测定中的期望灵敏度是通过包括重复洗涤和离心步骤的多步骤核酸分离程序得到。见Shamputa等人(2004) Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistance detection of mycobacteria from clinical specimens,122:728。然而这样的程序不可自动化，且对大多数使用者不实用。在使用MGP分离核酸的一般方法中，在样品中的细胞区室已被破碎以释放核酸后，使样品与MGP接触以实现核酸与MGP的结合。可在裂解前将MGP加入样品。例如，MGP可存在于将加入初始样品的容器中。已经发现，MGP的存在不影响样品的裂解。可选地，可首先裂解样品，并仅在裂解步骤完成后引入MGP。为了实现与MGP的结合，一般将样品与MGP混合并在此结合混合物中孵育足够的时间使结合发生。通过在不同时点测定固定在磁性玻璃颗粒表面上的核酸量，或通过在不同的孵育时间后测定核酸产量，可容易地最优化此步骤。一般，10秒至30分钟之间的孵育时间对核酸是合适的。在大多数情况下，包含释放的核酸的裂解试剂是适于MGP结合发生的环境。然而，在有些情况下，裂解试剂使环境不适于核酸结合至磁性玻璃颗粒的表面。特别是当磁性玻璃颗粒具有未修饰的表面时，核酸和颗粒表面之间的结合依赖于例如结合混合物的PH和离子强度的条件。已经发现，核酸与MGP的最大结合发生在低pH下，例如pH 5或更低。然而，对有些应用，可能不能达到结合混合物的这样低的pH。例如，用于裂解分支杆菌的裂解试剂具有12或更高的pH值。在用于分离分支杆菌核酸的一般程序中，在细胞裂解后的中和步骤期间降低pH，但不低于pH9。在pH 9或更高时，核酸与磁性玻璃颗粒的结合是低效的。迄今为止，通过延长的孵育时间克服此结合的低效率。这种解决问题的方式对临床应用是不现实的。此外，延长的孵育对核酸模板的稳定性有威胁，特别是RNA模板。专利技术概述 本专利技术是从包含核酸的样品溶液中分离核酸的方法，其包括使样品溶液接触能够结合核酸的固相和包含乙烯胺化合物的结合混合物；在核酸可结合固相的条件下孵育包含固相的样品溶液；和从溶液中分离固相。本方法任选地包含在洗脱前洗涤结合的核酸的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括在分离后检测核酸。本专利技术还包括用于分离核酸的反应混合物，所述混合物包含能够结合核酸的固相和乙烯胺化合物。本专利技术也包括使用固相从样品中分离核酸的试剂盒，所述试剂盒包含能够结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.01.08 US 12/684,7621.一种从包含核酸的样品溶液中分离核酸的方法，其包括 a.使样品溶液与能够结合核酸的固相和包含乙烯胺化合物的结合混合物接触； b.在核酸可结合固相的条件下孵育包含固相的样品溶液；和 c.从溶液中分离固相。2.权利要求I的方法，其还包括洗涤结合固相的核酸。3.权利要求I的方法，其还包括从固相洗脱核酸。4.权利要求I的方法，其中所述样品溶液通过裂解细胞得到。5.权利要求4的方法，其中所述样品溶液通过裂解选自芽孢杆菌梭菌iClostridium)，葡萄球菌{Staphylococcus'),链球菌(^Streptococcus')，肠球菌iEnterococcus),分支杆菌(Mycobacterium)及其组合的革兰氏阳性菌得到。6.权利要求I的方法，其中在步骤a中的所述结合混合物还包含金属离子。7.权利要求6的方法，其中在步骤a中的所述结合混合物包含镁或锰离子。8.权利要求I的方法，其中在步骤a中的所述结合混合物还包含碱金属氢氧化物和去垢剂。9.权利要求8的方法，其中在步骤a中的所述结合混合物包含等体积的溶液I(50mMNaOH, 1% Trit...

【专利技术属性】
技术研发人员：JA约翰逊，E凯格，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：
国别省市：