具有氧化还原酶活性的多肽及其用途制造技术

本发明专利技术涉及具有氧化还原酶活性的多肽或其变体多肽，所述多肽包含SEQ?ID?NO：3中公开的氨基酸序列或SEQ?ID?NO：4的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述变体多肽与SEQ?ID?NO：3的序列具有45％或更高的序列同一性。本发明专利技术还涉及用于生产2，5-呋喃二羧酸(FDCA)或生产5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMF酸)的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有氧化还原酶活性的多肽及其用途
本专利技术涉及具有氧化还原酶活性的多肽和包含编码该多肽的基因的多核苷酸序列。本专利技术还涉及2，5-呋喃二羧酸(2，5-Furan-dicarboxylicacid，FDCA)的生产。本专利技术还包括适用于生产这些多肽的、用根据本专利技术的多核苷酸转化的细胞，所述细胞也可以被用于将羟甲基糠醛(HMF)生物转化成FDCA。
技术介绍
2，5-呋喃二羧酸(FDCA)具有在聚酯如PET的生产中成为对苯二酸酯的基于生物的替代物的巨大潜能。因此和由于其他原因，FDCA在关于TopValue-AddedChemicalsfromBiomass的DOE报告中被鉴定为前12种最优选化学品之一(TopValue-AddedChemicalsfromBiomass，VolumeI-ResultsofscreeningforpotentialCandidatesfromSugarsandSynthesisgas，DepartmentofEnergy(USA)，2004)。该化合物可通过5-羟甲基糠醛(HMF)的氧化获得，所述HMF可通过在酸条件下加热己糖来生产。DOE报告在第27页公开了FDCA的一些可能的应用。这些应用包括作为用于生产琥珀酸、2，5-双(氨甲基)-四氢呋喃、2，5-二羟甲基-四氢呋喃、2，5-二羟甲基呋喃和2，5-呋喃二甲醛的底物的作用。尽管通过C6糖的化学氧化脱水进行的FDCA生产和FDCA的用途是公知的并且设置了第26页表13中所指出的技术障碍，但是对生物转化—可能的酶促转化—而言，状况是未知的。WO2009/023174中给出了用于酶促制备FDCA的方法。在所述公开中，用氯过氧化还原酶(chloroperoxidoreductase)氧化羟甲基糠醛物类，并且被过氧化氢氧化的产物在羟甲基糠醛(特别是甲酰呋喃羧酸或FFCA)的C1位置处具有羧酸基团。结果例如展示于图1中。在另一实施方案中，HMF在存在氧化底物时与氧化还原酶接触，从而将HMF氧化成至少二甲酰基呋喃或甲酰基呋喃羧酸之一。WO2009/023174中已知的方法的缺点在于，反应需要过氧化氢，并且形成的产物是FDCA与两种污染性副产物羟甲基呋喃羧酸(HmFCA)和甲酰基呋喃羧酸(FFCA)的混合物。因此，从HMF到FDCA的产率被降低，并且需要额外的回收步骤获得基本纯化形式的FDCA。在数据库EBI，UniprotB2T4R9中鉴定了一个577个氨基酸的序列，所述序列由作为“BurkholderiaphytofirmansPsJN的染色体1的完整序列”中葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶的同源性推断而来。在数据库EBI，UniprotB2JSZ0中鉴定了一个576个氨基酸的序列，所述序列由作为“BurkholderiaphymatumSTM815的质粒1的完整序列”中葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶的同源性推断而来。在Deurzen，M.P.J.etal，J.CarbohydrateChemistry16(3)，299-309(1997)中公开了氯过氧化物酶-催化的5-羟甲基糠醛的氧化。所述反应以针对呋喃-2，5-二甲醛(furan-2，5-dicarboxaldehyde，FDC)60-74％的选择性进行。副产物是5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HFCA)和5-甲酰基呋喃-2-羧酸(FFCA)。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供能够使用分子氧进行氧化还原反应的氧化还原酶。另一个目的是提供具有广阔反应谱的氧化还原酶。另一个目的是提供具有高区域特异性(regiospecificity)的氧化还原酶。本专利技术的另一个目的是提供用于生产FDCA的方法，其中可以避免大量的副产物。本专利技术的另一个目的是提供用于生产5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMF酸)的方法，其中能够避免大量副产物。一个或多个这些目的根据本专利技术被实现。本专利技术提供了编码具有氧化还原酶活性的多肽的多核苷酸。本专利技术的多核苷酸典型地编码具有氧化还原酶活性、特别是HmfH氧化还原酶活性的多肽。因此，根据本专利技术提供了具有氧化还原酶活性的多肽或其变体多肽，所述多肽包含SEQIDNO：3中公开的氨基酸序列或由SEQIDNO：4的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述变体多肽与SEQIDNO：3的序列具有45％或更多的序列同一性。这些氧化还原酶多肽提供了生产有附加价值的化合物FDCA的化学氧化途径的酶促替代方式，允许温和的反应条件(30℃，pH7)并生产更少的废物。所述氧化还原酶是真正的氧化酶(trueoxidase)，即氧化反应仅需要分子氧，省略了用于再生昂贵的辅因子的需求。所述酶提供广泛的反应特异性和区域特异性，将醇和醛基团均最终氧化成羧酸，而无论这些基团位于呋喃主链的C2或C5位。根据本专利技术还提供了并入本专利技术多核苷酸序列的载体，例如表达载体，和包含根据本专利技术的多肽、多核苷酸或载体的细胞。本专利技术还提供了用于制备具有氧化还原酶活性的多肽的方法和能够通过所述方法获得的多肽，所述方法包括在允许所述多肽表达的条件下培养本专利技术的细胞，并任选地回收所表达的多肽。本专利技术的另一个实施方案涉及使用强效的全细胞生物催化剂由富含(富集)果糖的进料流生产FDCA的集成方法。附图说明图1：由HmfH氧化还原酶催化的氧化的反应流程。图2：HmfH表达载体pJT’hmfH的质粒图谱。Ptac’，tac启动子；rep，编码pRO1600复制蛋白的基因；gmR，庆大霉素抗性基因；bla，β-内酰胺酶；pRO1600-ori，P.putida的复制起点；pUCori，E.coli的复制起点。图3：被鉴定为潜在的糠醛和/或HMF利用者的C.basilensisHMF14(A)和其他物种(B)中糠醛和HMF代谢基因的遗传构成的图示。图4：在P.putidaS12pJT’hmfH的粗制细胞提取物中由HMF形成FDCA、HMF-醇(H-oh)和HMF-酸(H-酸)。图5：在P.putida_pJT’hmfH的分批进料培养物中形成HMF酸和FDCA。左侧的箭头指出HMF进料的起点；右侧箭头指出对进料添加甘油。图6.在P.putida_pJT’hmfH的分批进料培养物中形成HMF和FDCA。箭头指出合并的HMF和甘油进料的起点。图7a：实施例VIII的分批进料发酵中，HMF酸、FDCA和生物质的浓度。7b：实施例VIII的分批进料发酵中甘油和HMF的进料速率。序列表概述SEQIDNO：1公开了引物FN23的DNA序列：5’-CGGAATTCCACATGACAAGGGGAGACCG-3’。加有下划线的序列指出EcoRI限制性位点；SEQIDNO：2公开了引物FN24的DNA序列；5’-CGGAATTCGCTTCGGTCTTCAACTCGGATG-3’。加有下划线的序列指出EcoRI限制性位点；SEQIDNO：3公开了HmfH的氨基酸序列；SEQIDNO：4公开了hmfH的编码序列。专利技术详述在本说明书和附带的权利要求书中，词语“包含”和“包括”及其变体如“包含”(″comprises″，″comprising″)、“包括”(″includes″and″including″)应被解释为开放式的。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在传达可能包括未明确指本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.09.02 EP 09169227.7;2009.10.08 EP 09172555.61.具有类别EC1.1和EC1.2的氧化还原酶活性的多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQIDNO:3所公开的。2.多核苷酸，其由以下组成：(a)SEQIDNO:4中公开的核苷酸序列；或(b)属于(a)中定义的核苷酸序列的反向互补体的核苷酸序列。3.包含根据权利要求2所述的多核苷酸的核酸构建体。4.载体，其并入有根据权利要求2所述的多核苷酸序列或根据权利要求3所述的核酸构建体。5.包含根据权利要求1所述的多肽、根据权利要求2所述的多核苷酸、根据权利要求3所述的核酸构建体或根据权利要求4所述的载体的细胞。6.根据权利要求5所述的细胞，其中所述细胞是：-选自下组的原核细胞，所述组由Escherichia、Anabaena、Caulobacter、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Rhizobium、Flavobacterium、Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Methylobacterium、Staphylococcus或Streptomyces组成；或-选自下组的真核细胞，所述组由Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、YarrowiaAspergillus、Chrysosporium、Penicillium、Talaromyces或Trichoderma组成。7.用于制备根据权利要求1所述多肽的方法，其中所述方法包括在允许所述多肽表达的条件下...

【专利技术属性】
技术研发人员：哈拉德·约翰·鲁杰瑟纳斯，尼克·约翰尼斯·皮特斯·维尔克斯，弗兰克·沃特·库普曼，阿德里安努·约翰尼斯·约瑟夫·斯特拉索夫，约翰尼斯·翰德里克·温德·德，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
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