使用过氧化物氧化还原酶1(PRX1)作为佐剂的方法和组合物技术

本发明专利技术提供用于激发针对抗原的免疫反应的组合物和方法。该组合物包括抗原和分离的Prx1蛋白，该抗原激发所需要的免疫反应。Prx1蛋白作为佐剂起作用以使这种包含抗原与Prx1的组合物激发的对该抗原的免疫反应强于仅用该抗原激发的免疫反应。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上涉及免疫治疗领域，更明确而言，本专利技术涉及使用Prxl作为佐剂来增强针对抗原的免疫反应。 _4]
技术介绍
Prxl是典型的2-半胱氨酸过氧化物氧化还原酶家族的ー员，其主要的胞内功能是通过其过氧化物酶的活性作为过氧化氢信号通路的调控因子和作为蛋白质的伴侶蛋白。Prxl的表达在各种癌症中会上调，包括食管癌、胰腺癌、肺癌、甲状腺滤泡癌和口腔癌。PrxI水平的升高与临床结果不理想和病人整体存活情况降低相关。最近的研究证实Prxl可以由非小细胞肺癌细胞分泌，该分泌可能通过ー种非经典的分泌途径。然而，分泌的Prxl的作用至今尚未知晓，之前也未就治疗目的加以探索。
技术实现思路
本专利技术提供了用于激发免疫反应的组合物和方法。这种组合物包括抗原和分离的Prxl蛋白。抗原和Prxl蛋白可以以复合物的形式提供，或者它们可以彼此共价连接。Prxl蛋白在复合物中可以以多聚体的形式存在。在一个实施方式中，所述多聚体是十聚体。组合物还可以包括接触过抗原和/或Prxl蛋白的抗原呈递细胞。抗原可以是用于激发所需要的免疫反应的任何抗原，包括但不限于传染源或癌细胞表达的抗原。在一个实施方式中，抗原由肿瘤细胞表达。在个体中激发针对抗原的免疫反应的方法包括给予该个体包含该抗原和分离的Prxl蛋白的组合物。所激发的免疫反应可强于该抗原在不给予分离的Prxl蛋白时所激发的免疫反应。激发的免疫反应可包括细胞介导的免疫反应、体液免疫及其组合。在一个实施方式中，激发针对抗原的免疫反应的个体是有风险发生、被怀疑患有或已经诊断患有癌症的个体。附图简要说明图I. Prxl刺激巨噬细胞分泌细胞因子(A)采用流式细胞仪检测TG诱出的巨噬细胞所表达的⑶llb、Grl和F4/80。示出3次独立分离的代表性柱状图，显示⑶Ilb+细胞的Grl和F4/80的表达情况。插入框中的数字表明是每个象限中CDllb+细胞的百分比。(B)将TG诱出的巨噬细胞和刺激物共同培养24小吋，收获上清液后分析TNF- α (空心柱)和IL-6 (灰色柱)的水平。结果以pg/ml为单位，代表了三组独立试验，误差线代表标准差。(C)将TG诱出的巨噬细胞分别如下培养24小时仅用培养基(黑色柱)；用IOOnM LPS或2000nM Prxl (空心柱)；用IOOnM LPS或2000nM Prxl，经lOug/mL多粘菌素B预孵育20分钟(阴影线柱)；100nM LPS或变性的2000nM Prxl (灰色柱)。星号表示与仅用Prxl或LPS处理过的细胞相比p彡O. 01。(D)将TG诱出的巨噬细胞分别以单独的培养基、Prxl (50nM)或LPS(IOOnM)培养24小时，灰色柱表示培养时添加10%的FBS，空心柱表示未添加10%的FBS。收获上清液，并分析IL-6的水平。结果以pg/ml为单位，误差线代表标准差。图2. Prxl刺激树突状细胞的成熟与激活。(A和B)将未成熟的骨髓来源的树突状细胞(iBMDC)分别以单独的培养基、20-200nM Prxl或IOOnM LPS培养24小时。(A)培养后，通过流式细胞仪分析细胞中⑶Ilc和⑶86的表达情況。结果显示为占所有细胞的百分比，误差线代表标准差。(B)收获上清液，并对TNF-α进行分析。结果以pg/ml为单位，代表三组独立实验，误差线代表标准差。(C)将TG诱出的巨噬细胞与如下培养基共同培养收获自培养转染有编码对照shRNA (乱序，Scramble)或Prxl特异性shRNA (shPrxl)的cDNA的前列腺肿瘤细胞系的培养基，或者是收获自培养表达Prxl特异性shRNA的细胞的培养基(其中添加了 50nM外源性的Prxl，shPrxl+Prxl)。培养24小时后收获上清液，对TNF-α进行分析。结果以Pg/ml为单位，代表三组独立试验，误差线代表标准差。 林P彡O. 01，与仅用培养基培养的细胞所分泌的TNF- α水平相比;## P ^ 0.01,与用获自表达对照shRNA的细胞的培养基培养的细胞所分泌的TNF- α水平相比 PS0.0丨，与用获自表达Prxl特异性ShRNA的细胞的培养基培养的细胞所分泌的TNF-α水平相比。图3. Prxl诱导的细胞因子分泌依赖于TLR4。(A)从 C57BL/6 小鼠(TLR4+/+;空心柱)和 C57BL/10ScNJ 小鼠(TLR4+ ;实心柱)分离得到iBMDC，分别用200nM PrxlUOOnM LPS或IOOmM Pam3Cys激发。收集上清液，用IL-6ELISA试剂盒分析。(B)从C57BL/6小鼠(TLR4+/+;空心柱)和C57BL/10ScNJ小鼠(TLR4+;实心柱)分离得到TG诱出的巨噬细胞，分别用200nM PrxlUOOnM LPS或IOOmMPam3Cys激发。收集上清液，用IL-6ELISA试剂盒分析。结果以pg/ml为单位；误差线代表标准差，星号表示P值小于O. 01。(C)向未处理的C57BL/6(TLR4+/+;空心柱)小鼠和C57BL/10ScNJ(TLR4^;实心柱)小鼠腹腔内注射200nm的Prxl。6小时后，采集血样，用ELISA分析IL-6的存在。结果以pg/ml为单位；误差线代表标准差，星号表示P彡O. 0002。图4 =Prxl和TLR4的相互作用依赖于CD14和MD2。(A)从C57BL/6小鼠中分离得到TG诱出的巨噬细胞，在存在或不存在对照或针对Prxl、CD14或MD2的封闭抗体的情况下用50nM Prxl刺激24小吋。收集上清液，用IL-6ELISA试剂盒分析。结果以pg/ml为单位；误差线代表SEM，星号表示P值小于O. 01。(B)收获TG诱出的巨噬细胞，如材料和方法中所述，用针对TLR4、TLR2和小鼠/山羊IgG的抗体沉淀细胞裂解物；所得沉淀物经SDS-PAGE分离并通过蛋白质印迹分析检测Prxl的存在。还用TLR4或TLR2的抗体检测印迹以作为内參照。(C)收获TG诱出的巨噬细胞，如材料和方法中所述，将细胞裂解物与针对TLR4或小鼠/山羊IgG的抗体共孵育；所得沉淀物经SDS-PAGE分离并通过蛋白质印迹分析检测Prxl、⑶14和MD2的存在。还用TLR4抗体检测印迹以作为内參照。图5 :TLR4/Prxl相互作用的动力学。(A) TG诱出的巨噬细胞经200nM的FITC-Prxl或PE连接的抗TLR4(PE-TLR4)激发。在指定的时间收集样品。样品和细胞群体通过安尼斯(Amnis)技术分析。图示为在每个时间点下，代表性的免疫染色细胞和两种染色合并后的图像。最右边的柱状图为通过所分析的每个细胞的像素统计分析(n=5，000)得出的像素柱状图，其中y轴表示的是细胞的数目，X轴表示的是Prxl和TLR4之间的相似系数。(B)图示为每个时间点所有细胞的平均相似系数；误差线表示标准差。图6. Prxl结合TLR4是结构依赖性。(A)从TLR4+/+(白色柱)或TLR4+巨噬细胞(实心柱)中分离得到TG诱出的巨噬细胞，然后分别与培养基(无添加)、200nM的Prxl、200nM的PrxlC52S或200nM的PrxlC83S培养24小时，收获上清液，分析TNF- α和IL-6的存在。⑶从TLR4+/+(白色柱)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.08 US 61/267,6471.一种组合物，其包含抗原和分离的过氧化物氧化还原酶I(Prxl)蛋白。2.如权利要求I所述的组合物，其特征在于，所述抗原是肿瘤抗原。3.如权利要求I所述的组合物，其特征在于，所述Prxl蛋白和所述抗原以复合物的形式存在。4.如权利要求I所述的组合物，其还包含抗原呈递细胞。5.如权利要求I所述的组合物，其特征在于，所述抗原呈递细胞是树突状细胞、巨噬细胞或其组合。6.如权利要求I所述的组合物，其特征在于，所述分离的Prxl蛋白以Prxl十聚体的形...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·O·戈尔尼克，J·里德尔，
申请(专利权)人：健康研究股份有限公司，
类型：
国别省市：