本发明专利技术公开了利用脂肪酰ACP还原酶生物合成脂肪醇的方法，该方法是将脂肪酰载体蛋白还原酶基因导入宿主细胞体内，并使该基因在该宿主细胞体内表达，从而改造异养微生物或异养细胞体内的脂肪酸代谢途径以生产脂肪醇。本发明专利技术还进一步通过代谢改造，提高脂肪醇的产量。本发明专利技术实现了在微生物体内通过生物合成的方法合成脂肪醇，该技术是一种可再生的、低消耗的技术，且这种环保的生产方式能够减少对稀缺资源石油的消耗，也不需要再进行化学改造就可以直接生产脂肪醇，在工业上有很大的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于可再生能源和生物质能源以及化工原料生产领域，具体涉及改造异养微生物自身脂肪酸代谢途径从而生产脂肪醇的方法。
技术介绍
脂肪醇(fatty alcohols)是洗漆剂用表面活性剂的原料之一,在洗漆剂、护肤品、化妆品、药品中有大量运用。脂肪醇最早是由鲸蜡制取的，所得的混合脂肪醇经磺化中和后成为硫酸盐，是最早的一种阴离子洗涤剂。其后开发利用来源比较丰富的椰子油、棕榈油和牛油为原料，水解所得脂肪酸再还原为醇，统称为天然脂肪醇。石油化学工业发展后，以石油产品为原料，生产的脂肪醇称为合成脂肪醇。全世界总的脂肪醇消费量大约在250万吨左右。至20世纪末，天然醇与合成醇的比例大致为4. 9 5.1。近年来由于石油原料价格持续高涨，加上美洲和亚洲地区对脂肪醇的需求增加，以及人们对天然原料脂肪醇的偏好， 增加了对天然脂肪醇的需求。脂肪醇的价格已高达2000美元每吨，目前全球有许多国家依然需要依靠进口满足脂肪醇的需求。但是依靠石油产品为原料的脂肪醇也大量消耗石油的储备量，在资源日益稀缺的今天，这种发展方式将会逐渐淘汰，因此，需要一种更环保、可再生的生产方式。如果能够通过在改造后的脂肪酸代谢通路中异源表达脂肪醇合成酶，即脂肪酰载体蛋白还原酶，即可以通过微生物发酵产生大量的脂肪醇。Michael 等人在 2000 年纯化了 jojoba 的 fatty acyl CoA reductase,并证明该基因-jojoba far能将脂肪酸还原成为脂肪醇,该工作发表在“Plant Physiology”(James G. Metz, Michael R. Pollard 1，LanaAndersonj Thomas R. Hayes, and MichaelW.Lassner. 2000. Purification of ajojoba embryo fatty acyl-Coenzyme A reductaseand expression ofits cDNA in high erucic acid rapeseed. Vol.122:635 - 644)。Tan等在缺乏合成脂肪醇能力的蓝细菌Syn-LY2菌株中分别表达了来自于jojoba，鼠，拟南芥等的脂肪酰辅酶A还原酶FAR，发现异源表达jojoba及其中一种拟南芥FAR的蓝细菌能够合成脂肪醇，而异源表达其他的几种FAR的蓝细菌不能产生脂肪醇。该工作发表在 “Metabolic Engineering，，上(Tan X，Yao L，Lu X. et al. 2010. Photosynthesisdriven conversion of carbon dioxide to fatty alcohols and hydrocarbons incyanobacteria. Metabolic Engineering 13 (2011) 169 - 176)。刘天里教授等人开发了一个“cell free”体系，将脂肪酸代谢途径中的限速步骤进行了研究，指导如何提高微生物体内的脂肪酸含量，该工作发表于“Metabolic Engineering” (Tiangang Liu，HarmitVorajChaitan Khosla. 2010. Quantitative analysis and engineering of fatty acidbiosynthesis in E. coli. Metabolic Engineering 12:378 - 386)。2011 年，石开究人员克隆并鉴定了一个参与单子叶植物水稻花药及花粉外壁发育的脂肪酰基载体蛋白还原酶DPW，研究揭不，DPW蛋白定位于质体中，重组蛋白可以脂肪酉先基载体蛋白为底物，将碳十六脂肪酸还原为其相应的脂肪醇，从而参与花药及花粉外壁的合成，并且通过遗传互补等实验证明DPW在双子叶植物拟南芥中具有保守的生物学功能(Shi J, Tan H，YuXH，Liu Y，Liang Wj Ranathunge K，et al. Defective pollen wall is required foranther and microspore development in rice and encodes a fatty acyl carrierprotein reductase.The Plant cell 2011;23:2225-46)。 2010 年，Andreas Schirmer等在Science上发表一项工作，其中证明了来自于蓝细菌PCC7942的一段基因序列PCC7942-orfl594 (AAR 基因)和 PCC7942_orfl593 共表达可以产生脂肪烷烃(SchirmerA, Rude MAj Li X，Popova Ej del Cardayre SB. Microbial biosynthesis of alkanes.Science 2010;329:559-62)。脂酰载体蛋白还原酶基因便于进行优化，目前可以进行遗传操纵的微生物种类繁多，脂肪酸合成代谢途径又是每种微生物生存的必需条件，并且目前的研究已经对该条途径认识较为深刻，其限速步骤基本清楚，利于进行改造。众所周知，由于异养微生物或异养细胞生长迅速并且需要外源补充营养物质，这就便于通过补充培养基或者增加某些营养成分来提高其生产能力，使其在工业上实现大规模产业化生产。并且由于其必须依赖人工补给养料，所以可以严格控制其生产的各个阶段，防止其肆意生长而造成无法控制的局面。目前工业上已经有许多利用异养微生物生产发酵获得产品的成功实例，利用脂酰载体蛋白还原酶基因在异养微生物体内通过改造其自身代谢途径生产脂肪醇有很大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用脂肪酰ACP还原酶生物合成脂肪醇的方法，在异养微生物或异养细胞体内改造其脂肪酸代谢途径以及表达外源蛋白以生产重要的化工原料一脂肪醇。为实现上述目的，本专利技术提供的利用脂肪酰ACP还原酶生物合成脂肪醇的方法，其是将脂肪酰载体蛋白还原酶基因导入异养微生物或异养细胞内，并诱导表达。所述脂肪酰载体蛋白还原酶基因编码SEQ ID No. 2或SEQ IDNo. 4所示的蛋白质。或者编码SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有DPW蛋白和AAR蛋白同等活性的由DPW蛋白和AAR蛋白衍生得到的蛋白质。优选为DPW基因和AAR基因。本专利技术所述异养微生物或异养细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、细菌细胞和蓝细菌细胞。此外，本专利技术方法还包括通过改造异养微生物或异养细胞的代谢途径或者根据其密码子的偏爱性对脂酰载体蛋白还原酶基因进行优化，以提高脂肪醇的产量。此外，本专利技术方法还包括对转化脂酰载体蛋白还原酶基因异养微生物进行耐受性筛选，获得优势菌株，从而提高脂肪醇的产量。其中，所述改造的异养微生物代谢途径是该微生物体内的脂肪酸代谢途径，包括提高脂肪酸产量或者降低脂肪酸产量用以生产脂肪醇的途径，例如在大肠杆菌中导入PMSD8质粒,过量表达fatty acetyl-CoA carboxylase,提本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用脂肪酰ACP还原酶生物合成脂肪醇的方法，其是将脂肪酰载体蛋白还原酶基因导入宿主细胞体内，并使该基因在该宿主细胞体内表达。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘天罡，刘然，付爱思，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：
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