一种抗菌肽GW13及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种抗菌肽GW13及其制备方法和应用。其氨基酸序列为：GlyLeuArgProLysTyrSer(ArgTrpLeu)2-NH2。其制备方法为：1)根据定点氨基酸片段截取方法，截取线性鸡β-防御素4羧基末端13个氨基酸片段，并去除二硫键，获得GW10(GlyLeuArgProLysTyrSerArgTrpLeu-NH2)片段，将特征性的三残基复合物ArgTrpLeu重复连接，获得GW13抗菌肽；2)使用多肽合成仪进行固相合成法合成肽树脂；经TFA切割后得到多肽，反相高效液相色谱纯化。本发明专利技术所得到的抗菌肽GW13具有较强的抑菌活性和较弱的溶血活性，治疗指数最高，具有很大的发展潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及ー种抗菌肽，具体涉及ー种抗菌肽GW13及其制备方法和应用。
技术介绍
抗菌肽是生物体内广泛存在ー种具有抗菌作用的活性多肽，是生物非特异性防御系统的免疫应答产物，具有广谱抗菌和抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及抗肿瘤等生物活性。抗菌肽的抑菌机理与抗生素不同，它是通过物理滲透作用于细菌细胞膜，破坏膜上磷脂双分子层，从而使膜内物质外流，导致细菌死亡，因此，抗菌肽不产生耐药性。抗菌肽本身是ー种多肽类物质，不存在残留性问题，所以抗菌肽是抗生素最理想的替代物，具有极为广阔的市场应用前景。目前，上千种抗菌肽已经从各种动植物 体中提取出来，但作为抗生素替代品用于医疗领域的抗菌肽却很少。限制抗菌肽成为抗生素替代物的原因有以下两个方面一方面是抗菌肽对于正常细胞，比如红细胞等也造成溶血作用，也就是细胞选择性低，那么，寻找ー种提高抗菌肽细胞选择性的方法势在必行。细胞选择性是抗菌肽对不同细胞的不同选择性作用，也就是对有害微生物有抑制或杀伤作用，而对正常细胞没有毒性作用。抗菌肽的治疗指数是评价其细胞选择性的关键性指标。抗菌肽的治疗指数越大，抗菌肽的细胞选择性就越高，说明该抗菌肽成为抗生素替代品的可行性越大。影响抗菌肽应用的第二个方面是，生产成本问题。目前对于抗菌肽的结构功能研究，主要通过化学合成的方法获得抗菌肽，氨基酸数目越多，合成成本越高，所以，细胞选择性高的抗菌小肽成为人们研究的热点。抗菌肽的种类繁多，结构复杂，因此很难找到统一的模型来代表所有抗菌肽进行研究。另夕卜，人们盲目的使用基因工程的方法表达抗菌肽，而没有对抗菌肽的结构和功能以及体外试验进行全面的摸索，导致表达得到的抗菌肽大多活性不高，或者具有溶血活性和细胞毒性。目前为止，已经有很多种方法来研究抗菌肽的结构和功能之间的关系。比如通过构建抗菌肽库的方法筛选抗菌肽，或利用最小化方法来得到仅含有几种氨基酸的全新抗菌肽等方法。本专利技术通过截取自然存在的天然抗菌肽的一段氨基酸残基片段，并将其羧基末端特征性三残基氨基酸复合物循环连接一次，设计得到全新抗菌肽。该三残基氨基酸残基包括，Arg (精氨酸；R)、Trp (色氨酸；W)、Leu (亮氨酸；L)。Arg是ー种碱性氨基酸，提供的正电荷可与细菌表面的负电荷发生静电吸引作用，而且这种吸引作用比其他两种碱性氨基酸(Lys和His)更强。Trp和Leu均是疏水性氨基酸，可与细菌表明的磷脂发生疏水性作用，破坏细菌的磷脂膜，从而产生生物学活性。研究发现富含Trp和Leu抗菌肽的抑菌潜カ强于其他疏水性氨基酸。国内外还未见到利用天然抗菌肽的羧基末端片段截取的小肽连接重复的(RWL)结构特征单元来研究抗菌肽结构与功能关系的报道和研究。
技术实现思路
本专利技术是为了得到抗菌活性较高而细胞毒性相对较低的抗菌肽，从而设计了ー种高细胞选择性的抗菌肽GW13及其制备方法。抗菌妝GW13 的氨基酸序列是=GlyLeuArgProLysTyrSer (ArgTrpLeu) 2_NH2抗菌肽GW13的制备方法如下I)根据定点氨基酸片段截取方法，截取线性鸡β -防御素4羧基末端13个氨基酸片段，并去除ニ硫键，获得GWlO抗菌肽，将典型片段ArgTrpLeu重复连接，获得GW13抗菌肽。2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂；将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到两条多肽；然后经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成多肽的制备；3)对抗菌肽的最小抑菌浓度和溶血活性进行了分析检测，并对其治疗指数进行计算，结果表明通过ArgTrpLeu叠加性连接，提高了肽的抗菌肽活性和治疗指数；GW13具有较高的细胞选择性，具有成为抗生素替代物的发展潜力。通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现GW13不但对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门 氏菌、鸡沙门氏菌，枯草芽孢杆菌、粪链球菌八种菌种有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。因而，综合来看，GW13是ー种具有较高应用价值的抗菌肽。附图说明图I为抗菌肽GWlO的质谱图；图2为抗菌肽GW13的质谱图。具体实施例方式实施例I : 线性鸡β -防御素4的氨基酸序列为Arg Tyr His Met Gln Cys Gly Tyr Arg Gly Thr Phe Cys Thr Pro151015Gly Lys Cys Pro Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Arg Pro；202530Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Trp Leu_NH23538定点截取线性鸡β -防御素4羧基末端13个氨基酸片段，并去除ニ硫键，获得GW10 (GlyLeuArgProLysTyrSerArgTrpLeu-NH2)片段。将典型片段ArgTrpLeu 重复连接，获得 GW13 (GlyLeuArgProLysTyrSer (ArgTrpLeu)2-ΝΗ2)抗菌肽。GWlO和GW13为氨基酸数量为10和13的小肽。实施例2 将上述两个抗菌肽使用多肽合成仪进行合成，方法为固相化学合成法，具体步骤为I)抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X (X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH (9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20°C避光下反应2小吋，过滤；沉淀TFA(三氟こ酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓縮，再加入10倍左右体积的预冷无水こ醚，_20°C沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心lOmin，收集沉淀，再用无水こ醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95 2. 5 2. 5混合而成； 使用O. 2mol/L硫酸钠(磷酸调节至ρΗ7· 5)进行柱平衡30min,用90%こ腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30 70 70 30混合)，流速为lml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进ー步纯化，洗脱液A为O. I % TFA/水溶液；洗脱液B为O. I % TFA/こ腈溶液，洗脱浓度为25% B 40% B，洗脱时间为12min，流速为lml/min，再同上收集主峰，冻干;抗菌肽的鉴定将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(见附图1、2)与表一中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95%。表I抗菌肽的设计权利要求1.ー种抗菌肽GW13，其特征在于，氨基酸序列为GlyLeuArgProLysTyrSer(ArgTrpLeu) 2-NH2。2.一种制备如权利要求I所述抗菌肽GW13的制备方法，其特征在于，方法如下1)根据定点氨基酸片段截取方法，截取线性鸡β_防御素4羧基末端13个氨基酸片段，并去除ニ硫键，获得GWlO GlyLeuArgProLysTyrSerArgT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌肽GW13，其特征在于，氨基酸序列为：GlyLeuArgProLysTyrSer(ArgTrpLeu)2？NH2。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：单安山，董娜，马清泉，胡婉宁，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：