菊黄东方鲀与红鳍东方魨三倍体的诱导制造技术

本发明专利技术是一种菊黄东方鲀与红鳍东方魨杂交三倍体的诱导方法，其主要步骤为选取发育成熟的红鳍东方鲀雄鱼和雌鱼、菊黄东方鲀的雄鱼和雌鱼，分别采集成熟卵和精液，人工受精，进行正反杂交；受精后3-7min用30-40℃的海水热休克处理5-20min，然后在15-20℃的海水中孵化，完成热休克法的三倍体诱导。本发明专利技术工艺简单，成本低，可操作性强，并且大大提高菊黄东方鲀与红鳍东方魨杂交三倍体的诱导率，据实验统计，所获得的菊黄东方鲀与红鳍东方魨杂交三倍体的人工诱导率高达100％，获得的三倍体具有良好的经济效益和社会效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种鱼类的制种方法，特别是涉及一种菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体的生产方法，该技术属于海洋生物

技术介绍
菊黄东方飩俗称艇巴、满天星等，主要分布于中国黄海、东海和渤海。而红鳍东方飩主要分布于北太平洋西部的日本、朝鲜半岛和中国沿海。红鳍东方飩是个体最大、经济价值较高的品种之一。因其肉质细嫩、味道鲜美、蛋白质高、营养丰富，素有“鱼类之王”的美誉，深受广大美食家的喜爱。 红鳍东方飩生长快，但是毒性大，国内不允许食用；菊黄东方飩生长慢，在江苏、上海地区有食用习惯，商品价值高，市场也很大。因此，想利用前者的生长优势，通过杂交，获得与菊黄飩形态特征相似，但是生长快的杂交飩，以提高商品价值。从国内外水产动物研究的趋势来看，三倍体技术是具有潜力的一种方法。三倍体水产动物由于具有不育性的特点，即性腺不能发育成熟或发育畸形，而不能繁殖后代，因此没有性成熟或繁殖方面的能量损耗，避免了繁殖阶段的生长停止或高死亡率。目前，三倍体水产动物在控制过度繁殖、加快生长速度等方面都显示了良好的效果。因此根据菊黄东方飩的特性，开发一种诱导方法，获得菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体，以提高菊黄东方飩的生长速度，提高其经济效益和社会效益是养殖业者的共同期盼。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体的诱导方法。本专利技术的步骤为I)选取性腺成熟的红鳍东方飩雄鱼和雌鱼、菊黄东方飩的雄鱼和雌鱼，分别采集精液和成熟卵子；进行正反杂交；2)将精液与卵粒均匀混合，室温静置2min，加入海水进行人工受精；3)三倍体获得将受精后3-7min的受精卵转移至30_40°C海水浴中进行热休克5-20min,抑制第二极体的形成及其排出，使染色体组加倍。4)解除休克将卵移至常温海水中孵化，按照普通菊黄东方飩苗种生产方法管理，培育菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体鱼苗。在步骤2)中，海水水温为15_20°C。在步骤3)中，海水中起始热休克的时间为受精后3_7min ;热休克持续时间为10_16min ；热休克温度为30_36°C。在步骤4)中，海水孵化的温度为15_20°C。更优选地，步骤3)中，海水中起始热休克的时间为受精后4-6min ;热休克持续时间为14_16min，热休克温度为34_35°C ;步骤4)中，海水孵化的温度为17°C。采用上述方法诱导，能够得到较高的诱导率。本专利技术的进一步方案为诱导得到菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体后，利用染色体核型分析、流式细胞仪等技术测定上述鱼体的染色体倍数，然后进行菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体培育。 本专利技术的有益效果在于I.本专利技术通过利用高温休克方法进行诱导，并通过控制诱导持续时间，抑制第二极体释放，从而大大提高菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体的诱导率，据实验统计，所获得的菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体的人工两导率高达100%。2.本专利技术工艺简单，成本低，可操作性强，避免了化学方法进行诱导带来的污染。3.采用本专利技术所述方法培育的菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体，具有生长速度快、个体规格大、养殖成活率高，抗病能力强、毒性低等优点，具有良好的经济效益和社会效益。在菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体诱导中，其中最优选的诱导条件为，选取性腺成熟的红鳍东方飩雄鱼和雌鱼、菊黄东方飩的雄鱼和雌鱼，分别采集精液和成熟卵子；进行正反杂交；受精后5min用35°C的海水浴热休克处理15min，抑制第二极体排出，然后在17°C的海水中孵化，完成热休克法的三倍体诱导。采用该条件进行菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体诱导，实验结果表明，孵化率=6. 69%，三倍体率达100%，相对三倍体数为35. 42%。附图说明图I菊黄东方飩二倍体鱼苗细胞DNA荧光分布直方图。图2红鳍东方飩二倍体鱼苗细胞DNA荧光分布直方图。图3菊黄东方飩母本X红鳍东方飩父本三倍体鱼苗细胞DNA荧光分布直方图。图4菊黄东方飩父本X红鳍东方飩母本三倍体鱼苗细胞DNA荧光分布直方图。具体实施例方式以下实验例和实施例将对本专利技术做进一步的说明。实验例I菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体的倍性鉴定采用德国Partec公司Cystain DNA Istep染液一步法染色,通过流式细胞仪测定细胞DNA含量来鉴定倍性。I、组织细胞悬液制备及测定采用随机抽取方式对5-8日龄10尾菊黄东方飩母本X红鳍东方飩父本三倍体和10尾菊黄东方飩父本X红鳍东方飩母本三倍体进行鉴定，每次以10尾菊黄东方飩二倍体和10尾红鳍东方飩二倍体作为对照。(I)组织细胞提取及DNA荧光染色取每一尾鱼的活体尾鳍约1mm3，放入I. 5mL微量离心管中，加入Cystain DNA Istep染液O. 5ml,剪碎尾鳍组织至肉眼看不见块状物,再轻轻研至均衆状；用300目德国Partec公司生产的细胞过滤网过滤,再向滤液中加入CystainDNA Istep染液O. 5ml,进一步染色。(2)流式细胞仪测定PARTEC为德国Partec Gmbh公司生产，型号PA，该机激发光源为负离子激光器。测量前，用鞘液调整细胞浓度在I X 106个/ml左右，测量时保持测量速率在200 300个/S。选正常二倍体细胞悬液为对照样品。(3)检测控制测定前调校流式细胞仪使管道畅通，喷嘴清洁，仪器处于最佳状态，进行FL0WCHECK校正，使各通道的变异系数(CV)稳定在3%以下，DNA含量由仪器自动检出。通过控制流速保持细胞分离纯度。2、检测原理与表示方法以二倍体对照组细胞为参考计算二倍体和三倍体频率，细胞DNA含量以DNA指数(DNAindex, DI)表不。DI =处理组细胞G0/1峰值道数/对照组细胞G0/1峰值道数均值以DI = I. 0±0. I为DNA 二倍体的判断标准。如果DI = I. 5±0. 1，则为三倍体。对三倍体处理组与二倍体对照组的DNA进行分析(表I)，结果表明二者细胞DNA的G0/1峰值道数差异显著。流式细胞仪给出的对照组与三倍体处理组细胞DNA含量荧光分布直方图见图I-图 4。表I三倍体处理组与二倍体对照组的DNA比较(均值) 权利要求1.一种高温休克诱导菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体的方法，其特征在于包括如下步骤 1)选取性腺成熟的红鳍东方飩雄鱼和雌鱼、菊黄东方飩的雄鱼和雌鱼，分别采集精液和成熟卵子；进行正反杂交 2)将精液与卵粒均匀混合，搅拌后室温静置2min，加入海水进行人工受精； 3)三倍体获得将受精后3-7min的受精卵转移至30_40°C海水浴中进行热休克处理5-20min,使染色体组加倍。4)解除热休克将卵移至海水中孵化，按照普通菊黄东方飩苗种生产方法管理，培育菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体鱼苗。2.如权利要求I所述的菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体诱导方法，其特征在于 步骤2)中，海水水温为15-20°C。3.如权利要求I所述的菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体诱导方法，其特征在于 步骤3)中，海水中起始热休克的时间为受精后3-7min ;热休克持续时间为10_16min ； 热休克温度为30-36 °C。4.如权利要求I所述的菊黄东方飩与红鳍东方飩杂交三倍体诱导方法，其特征在于 步骤4)中，海水孵化的温度为15-20°C。5.如权本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高温休克诱导菊黄东方鲀与红鳍东方魨杂交三倍体的方法，其特征在于包括如下步骤：1)选取性腺成熟的红鳍东方鲀雄鱼和雌鱼、菊黄东方鲀的雄鱼和雌鱼，分别采集精液和成熟卵子；进行正反杂交2)将精液与卵粒均匀混合，搅拌后室温静置2min，加入海水进行人工受精；3)三倍体获得：将受精后3？7min的受精卵转移至30？40℃海水浴中进行热休克处理5？20min，使染色体组加倍。4)解除热休克将卵移至海水中孵化，按照普通菊黄东方鲀苗种生产方法管理，培育菊黄东方鲀与红鳍东方魨杂交三倍体鱼苗。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张福崇，刘海金，赵振良，赵文江，范文涛，赵海涛，刘永新，
申请(专利权)人：河北省水产研究所，中国水产科学研究院北戴河中心实验站，
类型：发明
国别省市：