一种快速高效的均一化全长cDNA文库构建方法技术

一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，该方法利用特定的5-OH寡核苷酸封闭非全长mRNA，在用烟草酸焦磷酸酶除去mRNA5′端的帽子结构，使mRNA5′端帽子结构处的磷酸基团暴露出来，用高效的RNA连接系统在mRNA的5′端连上一段优化的寡聚核糖核酸作为引发第二链cDNA合成的引物结合位点，最后经反转录，二链合成、分级纯化后，将双链DNA克隆于载体中。该方法具有简洁高效的全长mRNA筛选功能，实现对真核生物全长mRNA的捕获，mRNA5′末端含有生物素标记，可用于全长mRNA分离，所用寡核苷酸引物含有优化的修饰方法及核苷酸序列，可实现真核生物mRNA全场捕获、反转录以及DNA的合成。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于现代分子生物学

技术介绍
全长cDNA文库不仅能大大提高基因测序和生物信息学分析的进程，还利于后期蛋白质表达及功能分析，也是高效、大规模获得基因序列信息的一条有效途径，尤其是对基因组庞大，近期内尚不能进行全基因组测序的生物来说更是进行功能基因组研究的一条重要途径。即使在模式生物，如拟南芥、水稻、秀丽线虫等全基因组测序完成后，分子生物学家们仍旧构建了相应生物的全长cDNA文库，并进行了大规模的全长cDNA测序，以深入了解基因的功能。如拟南芥(A. thaliana),小鼠(M. musculus),果蚬(D. melanoga ster),水稻(O. sati2va)等等，产生了大量有价值的数据，由此科学家们也取得了很多全新的研究成·果，极大地促进了功能基因组学研究，推动了医学、农业和环保生物技术产品的开发。构建高质量全长cDNA文库是一个技术难度大、成本高、耗时长的重要生物技术。首先，获取完整的mRNA比较困难；其次，全长cDNA也不易得到；第三，有效区分全长和截短的基因非常棘手；第四，由于基因序列长短不同，克隆生长快慢也不一致，很容易导致小片段基因的富集。而基于普通cDNA文库中的基因片段来获取全长基因的方法(如RACE技术)在整个基因组范围内大规模、高通量地发掘新基因是难以想象的。此外，要想获得高质量有价值的全长cDNA文库，mRNA的均一化处理非常关键。全长cDNA文库在一定程度上解决了大规模获得全长cDNA的问题，但如果想通过大规模测序来发掘新基因，还有一个无法回避的现实问题就是冗余序列。为了提高发掘稀有表达新基因的效率，还需要对全长cDNA文库进行差减/均一化。目前有基于DNA复性动力学原理或基因组饱和杂交的方法进行cDNA文库的均一化处理方法。前者利用DSN (duplex-specificnuclease)特异降解mRNA/DNA双链中的DNA，后者将具有互补性的基因组DNA固定在磁珠上，与文库质粒进行杂交，收集流出组分。目前，在全长cDNA文库构建方面已经取得了很大的进展，全长cDNA文库的构建方法也不断涌现，其中主要有=CAPture法I、Oligo-capping法2、SMART3法、以及Cap-jumping 法 4 等。I. CAPture 法CAPture 法(mRNA Cap Retention Procedure)利用真核生物 mRNA 的帽子结构和帽子结合蛋白(转录起始因子eIF-4e)相互作用的动力学原理来捕获全长cDNA。首先，在反转录酶的作用下将mRNA转录为cDNA，形成cDNA/mRNA双链复合体；接着，用RNaseA对cDNA/mRNA双链分子进行酶切。如果反转录不彻底，cDNA没有延伸到mRNA的帽子结构部位，那么靠近mRNA5丨端的mRNA将以单链形式存在，这种情况下，RNaseA就能将这类mRNA的帽子结构切除掉，因此这类cDNA/mRNA双链复合体也就不再携带帽子结构。CAPture法采用RNAseA酶切cDNA/mRNA复合体，以除去短截的(没有完全转录)复合体中mRNA5 ’端的帽子结构。但RNaseA具有碱基偏爱性，它能够有效切割富含嘧啶的单链RNA，而对嘌呤含量较高的mRNA消化效率却很低，甚至不能切割。一般来说，mRNA的5 ’端G+C含量普遍较高，尤其在5 '端非编码区，这种现象更为明显，也正是由于这种原因，致使短截cDNA掺入到全长cDNA中，导致全长cDNA在文库中的比例下降，文库中全长cDNA的比例不是很高(60% 70% )。2. Oligo-capping 法Oligo-capping 法(Oligo-capping)利用细菌喊性憐酸酶(Bacterial alkalinephosphatase BAP)水解5丨端不完整的mRNA的5丨磷酸团，防止短截的mRNA在后续反应中与寡聚核糖核酸连接；接着，用烟草酸焦磷酸酶(Tobacco acid pyrophosphatase TAP)除去mRNA5 ’端的帽子结构，使mRNA5 ’端帽子结构处的磷酸基团暴露出来；然后，用T4RNA连接酶mRNA的Y端连上一段寡聚核糖核酸，作为引发第二链cDNA合成的引物结合位点， 最后经反转录，PCR扩增、酶切、连接，建成目的文库。Oligo-capping法构建cDNA文库涉及多种酶促反应,酶的效率将直接影响文库的最终质量。实验中所用的T4RNA连接酶对文库的构建至关重要，通常RNA连接酶的连接效率没有DNA连接酶高。此外，该方法涉及PCR扩增，而PCR反应常常会由于模板DNA的长度不同，G+C碱基的含量高低不一致以及模板自身的二级结构等因素的影响，导致扩增产物之间比例失调，甚至有些基因由于自身结构比较复杂，无法用PCR的方法进行扩增。以上不利因素都会影响稀有表达基因的发掘。3. SMART 法SMART 法(Switching Mechanism At5 1 end of RNA Transcript method/SMARTmethod)利用反转录酶PowerScript RT的末端转移酶活性来实现的。当反转录达到mRNA的5 '端时，PowerScript RT就能够在双链核酸的3 '端添加几个脱氧胞卩密唳(dC),而对于非全长cDNA,由于反转录延伸没有达到mRNA的5 '端,Powerscript RT不能在其不完整的3'末端加上dC。在cDNA第二链合成时,3 '端携带oligo(dG)的第二链引物也就不能与短截的ss-cDNA结合，因而这类cDNA不能合成互补链，最终得到的dsDNA都是全长的。SMART法设计很巧妙，但也存在一定的缺陷。由于相当多的cDNA内部存在寡聚dC，而这种方法在第二链cDNA合成时复性温度不是很高，有些存在于基因内部的寡聚dC有机会与末端携带几个dG的第二链引物退火，从而在cDNA的内部引发第二链cDNA的合成，导致文库中短截cDNA的比例升高。此外，由于cDNA的5 '端G+C含量较高，所以这类事件发生的几率也大大提高(大规模测序的结果也证明了这一点)。4. Cap-trapper 法Cap-trapper法(Cap-trapp er method)利用高碘酸钠的氧化特性，在低温、避光条件下特异氧化cDNA/mRNA复合体中mRNA5 ^和3 ^端末位核糖上的两个相邻的羟基(2-20H和3-20H)。经NaI04作用后，mRNA两端的邻二醇基团被氧化成二醛基团，后者在一定条件下能够与生物素结合，而生物素化的cDNA/mRNA复合体可被链霉亲和素包被的磁珠来分离出来。此外，采用RNase I对双链复合体进行酶切，RNase I可以消化以单链状态存在的mRNA，而且没有碱基特异性。在第二链cDNA的合成时，第二链引物结合位点的引入可采用两种方法一种是通过末端转移酶在单链cDNA的3 '端加上一段poly (G)，另一种是在利用DNA连接酶在cDNA的3丨端加上一段寡核苷酸。Cap-trapper法和Cap-jumping法均利用高碘酸钠来氧化mRNA5 '和3'端核糖上的邻二醇基团，使之变为二醛基团。步骤繁琐，效率低，耗时间，不利用高通量文库构建。现有构建全长cD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，包括mRNA的差减/均一化处理，全长cDNA的获得，二链cDNA的合成及文库的获得，其特征在于差减/均一化处理采用直接在磁珠上合成cDNA第一链后与mRNA进行杂交后，用磁珠分离法将高表达的mRNA除去得到稀有表达的mRNA；全长cDNA的获得以及二链cDNA的合成结合改进后的Oligo？capping法一步获得全长mRNA以及改进后的Cap？trapper法获得第二链cDNA。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昊澍，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：北京诺兰信生化科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：