本发明专利技术涉及蛋白质的分离纯化领域，具体地，本发明专利技术涉及一种用离子液体及酶法提取分离饼粕中蛋白质的新方法。根据本发明专利技术所述的用离子液体及酶法提取分离饼粕中蛋白质的方法包括以下步骤：1)将原料饼粕粉碎过筛，脱脂，得到脱脂饼粕粉；2)?pH7~10，温度40~65?℃，料液比1:7~1:15条件下将脱脂饼粕粉进行酶解，总酶活为90~250?U·g?-1，酶解2~5?h后离心分离；3)步骤2)?所得的沉淀和酶解液进行碱溶酸沉，冷冻干燥，得到粗蛋白品；4)将步骤3)中的粗蛋白加到离子液体/盐双水相体系中，在温度40~70?℃，pH?4~9下分离纯化蛋白；5)将步骤4)中的离子液体相用膜分离法分离蛋白质并且回收离子液体，冷冻干燥得到高纯度蛋白粉。本发明专利技术的操作简单、无污染，蛋白质纯度高且保持其生物活性，是一种绿色节能且高效的蛋白质分离纯化新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质分离纯化领域，具体涉及一种利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法。
技术介绍
油料饼柏一般含有蛋白、多酚、植酸、多糖等具有较高利用价值的成分。饼柏是一种潜在营养价值很高的植物蛋白资源，其蛋白含量为359^40%，这是饼柏中利用价值最高的成分。这种蛋白中含有大量人体所需的多种必须氨基酸，因此也是极为重要的食品蛋白质源。我们在此以菜籽柏中的菜籽蛋白为例，菜籽饼柏氨基酸总量占其蛋白质总量的83. 8%， 其赖氨酸含量和大豆接近，而蛋氨酸含量比大豆还高，适用于用来补充谷物和许多缺乏这类氨基酸的豆类。与其它蛋白质相比，菜籽蛋白质的优势在于①其氨基酸组成模式与FAO及WHO推荐模式很接近，比大豆蛋白更理想；②含硫氨基酸一蛋氨酸、胱氨酸和组氨酸含量比大豆浓缩蛋白为高。含硫氨基酸是食品中一类最重要氨基酸，也属必须氨基酸，在食品感观功能、营养功能和理调节功能方面作用重大。菜籽蛋白富含谷物中所缺少的含硫氨基酸与碱性基酸，可弥补谷物氨基酸缺陷。我国膳食结构以谷物为主，菜籽蛋白可弥补我国人民膳食结构不足，更好地满足食品等生产和国人生活对蛋白质需要。离子液体是近十年来迅速发展起来的一种可替代传统挥发性有机物的绿色溶剂，离子液体具有不易挥发、不可燃、稳定性高、溶解能力强、功能可调节等优点。离子液体可与多种物质如盐、糖、表面活性剂等形成双水相体系，其在萃取分离生物物质方面表现出优异的性能，这无疑会开拓一种新的绿色分离技术。传统的提取分离蛋白质的方法仍存在着提取率低、成本高且操作复杂等缺点，因此寻找一种高效、绿色且经济的提取分离蛋白质的方法已成为技术研究的重点。因而，专利技术者根据离子液体-盐双水相体系较传统双水相技术所不具备的诸多优点，如操作简单、无污染、分离效率高、可控制乳化、可循环使用离子液体等，结合酶解提取蛋白质的技术，研究开发了一种更加高效且经济的绿色分离饼柏中蛋白质的新技术。同时本方法在提取分离中极大限度地保持了蛋白质的生物活性不受破坏，提高了蛋白质的品质。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案实现一种利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，包括以下步骤(I)将原料饼柏粉碎过筛后用有机溶剂脱脂，得到脱脂饼柏粉；(2)将步骤(I)所述的脱脂饼柏粉与pH值为7 10的缓冲溶液混合后加入复合酶制成混合液，将混合液在4(T65 °C条件下酶解2 5 h后，离心分离，得到酶解液和沉淀；所述脱脂饼柏粉与缓冲溶液的料液质量比为1:7 1:15，所述混合液中的总酶活为9(T250U g ；(3)然后将步骤(2)所述的沉淀碱溶后离心分离，将分离得到的上清液与步骤(2)所述的酶解液合并后，进行酸沉并离心分离，将沉淀水洗后冷冻干燥，得到粗蛋白；(4)将步骤(3)得到的粗蛋白加到离子液体/盐双水相体系中，在温度4(T70 °C、PH4、的条件下震荡后再静置，取上层离子液体相；(5)最后将步骤(4)的离子液体相用膜分离法分离蛋白质，并回收离子液体，将蛋白质冷冻干燥得到高纯度蛋白粉。 上述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其在于，所述复合酶中的酶为a-淀粉酶和纤维素酶，或者a-淀粉酶、纤维素酶和果胶酶，且a-淀粉酶和纤维素酶的酶活力比为5:广2:3。上述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其在于，混合液中，a -淀粉酶和纤维素酶的酶活力分别为6(Tl50 U g ―1和3(T90 U g '上述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其在于，所述的缓冲溶液为磷酸缓冲液或硼酸缓冲液。上述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其在于，所述的步骤(4)中所述粗蛋白的浓度为2(Tl00 mg*!/1，所述离子液体的浓度为20(T600 mg-mL—1，所述盐的浓度为9(T220 mg -mr1 ;优选为所述粗蛋白的浓度为5(T80 mg吨―1，所述离子液体的浓度为30(T400 mg 所述盐的浓度为130 180 mg mL_10更进一步优选为粗蛋白的浓度为70 80 mg .171,离子液体的浓度为350 380 mg *mL 盐的浓度为150 180 mg .mL'所述的离子液体/盐双水相体系为亲水性离子液体/盐双水相体系，所述的离子液体为亲水性咪唑类离子液体、吡啶类离子液体或胍类离子液体，所述的盐为磷酸盐、碳酸盐或硫酸盐。所述的亲水性咪唑类离子液体为Cl、 Cl或BF4,所述的卩比卩定类离子液体为Br或BF4,所述的磷酸盐为K2HPO 4、KH2P04 *K3P04，所述的碳酸盐为NaHC03、Na2CO3或(NH4) 2S04 ;优选的所述的离子液体/盐双水相体系为 C1/K2HP04、Cl/K2HP04、 Br/K2HPO4、 BF4A2HPO4。更进一步优选为 C1/K2HP04。步骤⑵和步骤(3)中所述离心分离的离心速度为3000 5000 r mirT1。步骤(3)中沉淀水洗的次数为3飞次；步骤⑷中，所述震荡的时间为2(T50min，震荡速度为100 300 r mirT1，所述静置的时间为3(T60min。步骤⑴中所述的有机溶剂为石油醚、环已烷、正已烷或四号溶剂。本专利技术技术方案步骤(3)中用碱溶酸沉法得到粗蛋白，其中“碱溶酸沉”为本领域技术人员所公知的。利用蛋白质“碱溶酸沉”的原理，即蛋白质在碱性条件下，比较容易溶解于水中(萃取)，然后在酸性条件下到达等电点(蛋白质在等电点时溶解度最小)时，蛋白质容易聚集沉淀的原理，将蛋白提取出来。本专利技术原料饼柏优选是低温或高温压榨过的饼柏。本专利技术中使用的酶是a -淀粉酶和纤维素酶的混合物，或者a -淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的混合物。申请人曾经有用其他几种方法提取蛋白质或别的酶进行酶解，但是结果都不是很理想，存在的问题较多，其关键在于如何解决高效、保持蛋白质的高级结构且维持生物活性的问题。如果使用传统的碱溶酸沉法提取蛋白质，提取率较低，且时间较长。如果使用蛋白酶进行酶解反应，蛋白酶或酶解条件选择不当，蛋白质会被水解成多肽，失去高级结构。申请人研究发现在PH为疒10，温度40 65 °C，料液比1:7 1:15的饼柏反应液中只添加少量a-淀粉酶和纤维素酶的混合物或者a-淀粉酶、纤维素酶和或果胶酶的混合物，便可以使提取率提高，成功地完成了此项专利技术。a -淀粉酶、纤维素酶、果胶酶能够分别水解淀粉、纤维素和果胶，以有效降解植物细胞壁的纤维素骨架、崩溃植物细胞壁，从而将蛋白质释放出来而又不破坏蛋白质的结构。当a-淀粉酶和纤维素酶混合作用，或者a-淀粉酶、纤维素酶和果胶酶混合作用时能较好的体现上述机能，此时，a -淀粉酶和纤维素酶的酶活分别为6(T150 U g ―1和3(T90 U g1O本专利技术研究发现如果酶用量过多，其对蛋白质的提取率影响不大但浪费资源，且对蛋白质的组成及测定产生一定的影响。因此，本专利技术中最好把总酶活控制在9(T250 U . g -1,a-淀粉酶与纤维素酶的酶活力比在5:广2:3。另外，本专利技术中使用的a-淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的原料应该首选酶活高的品种，这样可能节省成本提高效益，以上几种酶均可以从市场购得。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用离子液体及酶法提取分离饼粕中蛋白质的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)？将原料饼粕粉碎过筛后用有机溶剂脱脂，得到脱脂饼粕粉；(2)？将步骤(1)所述的脱脂饼粕粉与pH值为7~10的缓冲溶液混合后加入复合酶制成混合液，将混合液在40~65？℃条件下酶解2~5？h后，离心分离，得到酶解液和沉淀；所述脱脂饼粕粉与缓冲溶液的料液质量比为1:7~1:15，所述混合液中的总酶活为90~250？U·g？？1；(3)？然后将步骤(2)所述的沉淀碱溶后离心分离，将分离得到的上清液与步骤(2)所述的酶解液合并后，进行酸沉并离心分离，将沉淀水洗后冷冻干燥，得到粗蛋白；(4)？将步骤(3)得到的粗蛋白加到离子液体/盐双水相体系中，在温度40~70？℃、pH4~9的条件下震荡后再静置，取上层离子液体相；(5)？最后将步骤(4)的离子液体相用膜分离法分离蛋白质，并回收离子液体，将蛋白质冷冻干燥得到高纯度蛋白粉。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓庚，刘琴，陈梅梅，潘春淋，高梅，万忠民，曹崇江，彭冬梅，王立峰，吴珂，
申请(专利权)人：南京财经大学，
类型：发明
国别省市：
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