用于产生戊烯二酸的方法技术

本发明专利技术涉及通过培养共表达戊烯二酸辅酶A转移酶和2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶系统的重组微生物来进行不饱和二羧酸的生物催化产生的方法。本发明专利技术还涉及对应的重组宿主，适合用于制备这类宿主的重组载体、表达盒和核酸，以及利用通过该生物催化产生方法获得的该二羧酸制备聚酰胺或聚酯共聚物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及通过培养共表达戊烯二酸辅酶A转移酶和2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶系统的重组微生物来进行不饱和二羧酸的生物催化产生的方法。本专利技术还涉及对应的重组宿主，适合用于制备这类宿主的重组载体、表达盒和核酸，以及利用通过该生物催化产生方法获得的该二羧酸来制备聚合物，例如聚酰胺或聚酯共聚物的方法。
技术介绍
戊烯二酸是累积在患有I型戊二酸血症的个体中的a，￠-不饱和C5 二羧酸(2-戍烯二酸)(Hoffmann GF, Zschocke J (1999) Glutaric aciduria type I :fromclinical，biochemical and molecular diversity to successful therapy. JInheritMetab Dis 22:381-391)。戊烯二酸与二胺一起可以聚合为涉及Nylon 的聚酰胺。用于戊烯二酸的生物技术产生的理想材料可以是可以通过糖发酵产生的谷氨酸。化学脱氨基a-氨基酸为a，￠-不饱和酸非常困难。相反，严格厌氧菌发酵氨基酸球菌 (Acidaminococcus fermentans)和共生梭菌(Clostridium symbiosum)可以容易地通过a-氧代戊二酸、(R)-2-羟基戊二酸、(R)-2-羟基戊二酰辅酶A和戊烯二酰辅酶A脱氨基谷氨酸为(E)-戍烯二酸(Buckel W(2001b) Unusual enzymes involved in five pathwaysofglutamate fermentation. Appl Microbiol Biotechnol 57 :263-273)。发酵氨基酸球菌和共生梭菌不适合用于戊烯二酸的产生，因为它们脱羧基戊烯二酰辅酶A为巴豆酰辅酶A。尚未建立起这些生物的遗传操作。因此，不能将编码戊烯二酰辅酶A脱羧酶的基因减弱至低水平，而彻底缺失将剥夺这些生物产生ATP的能力。此外，最终的目的是不从谷氨酸，而从发酵氨基酸球菌和共生梭菌不能在其上生长的葡萄糖产生戊烯二酸。因此，本专利技术的目的是提供用于戊烯二酸和相关二羧酸或其对应的盐的发酵性生物催化产生的适宜方法。附图描述图I显示戊烯二酸产生的途径。用1、2和3编号最后的步骤的酶。I :2_羟基戊二酸脱氢酶；2 :戊烯二酸辅酶A转移酶；3 :2_羟基戊二酰辅酶A脱水酶。图2图示其中插入2-羟基戊二酸脱氢酶(hgdH)和戊烯二酸辅酶A转移酶(gctAB)(亚基A和B)的编码序列(图2B)的重组质粒pACY⑶uet-1 (图2A)的构建。图3图示其中插入2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶(亚基hdgA和hgdB)及其激活蛋白(activator, hdgC)的编码序列(图3B)的重组质粒pASK_IBA3plus (图3A)的构建。专利技术概述通过本专利技术教导的用于产生不饱和二羧酸化合物，如戊烯二酸或结构上类似的戊烯二酸化合物(式I)的生物催化方法来解决上述问题，该方法包括在共表达戊烯二酸辅酶A转移酶和2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶系统的重组微生物中转化对应的2-羟基取代的二羧酸，以便形成该不饱和二羧酸。例如，为了将大肠杆菌(Escherichia coli)转化为戊烯二酸生产者，本专利技术人表达了编码2-羟基戊二酸脱氢酶(HgdA，图I中的I)、戊烯二酸辅酶A转移酶(GcdAB，2)、2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶(HgdAB，3)及其激活蛋白(HgdC，3)的六个基因。该新途径可以在衍生自葡萄糖的a -氧代戊二酸处经Embden-Meyerhof途径和柠檬酸循环转向。专利技术详述I.优选实施方案在本专利技术的第一实施方案中，提供用于产生通式I的不饱和二羧酸化合物的生物催化方法，尤其是这种化合物的E形式的生物催化方法HOOC-CH = CH-X-COOH (I)其中，X代表优选具有1、2、3或4个碳原子的直链或支链、任选不饱和、任选取代的烃基； 该方法包括-在允许形成希望的产物的条件下，且尤其是或任选在存在辅酶A(CoA)源，如脂酰辅酶A，如C2-C6脂酰辅酶A，且尤其是乙酰辅酶A的情况下(该辅酶A源可以具有任意来源，如对该微生物而言是内源的，即由该微生物产生，或者外源的，即加至该微生物或产生培养基)，和/或任选在存在形成式I的化合物所需或改善式I化合物的形成的任意其他外源或内源因子的情况下，在共表达戊烯二酸辅酶A转移酶(E. C. 2. 8. 3.12)和2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶系统的重组微生物中转化2-羟基取代的二羧酸III化合物，以便形成该式I的化合物HOOC-C (OH) H-CH2-X-COOH (III)其中X如上文所定义；-和任选各自以其盐的形式或作为游离酸，以基本上纯的立体异构体的形式(例如Z形式或尤其是E形式)或作为立体异构体的混合物分离该式I的化合物。在式I的化合物中，该基团X优选可以选自n是从I至4的整数的(CH2)n、CH =CH、CH2-C ( = 0)或 CH = C (OH)。尤其是，X 选自 CH2、C2H4' CH = CH 和 CH = C (OH)。根据本专利技术，优选通过该重组微生物在2-羟基戊二酸脱氢酶(E. C. I. I. I.-)催化的式II的2-氧代-二羧酸化合物的转化中形成该2-羟基取代的二羧酸III :HOOC-C ( = 0) -CH2-X-COOH (II)其中X定义于上文。尤其是，该重组微生物可以也共表达该2-羟基戊二酸脱氢酶。在本专利技术的该方法中，将该式II的氧代-二羧酸化合物加至该重组微生物或通过该重组微生物发酵性产生该式II的氧代-二羧酸化合物。尤其是，本专利技术的方法包括培养至少一个重组微生物，该微生物衍生自亲本微生物，该亲本微生物具有产生该式II的2-氧代-二羧酸化合物作为代谢途径的中间产物的能力，还具有异源表达上述酶和蛋白质中的至少一个的能力。例如，该微生物是代谢谷氨酸和/或葡萄糖的需氧或厌氧重组菌，且该式II的化合物是通过谷氨酸(例如通过谷氨酸脱氢酶的作用)和/或葡萄糖(例如通过Embden-Meyerhof途径和Krebs或朽1檬酸循环)的生物降解形成的2-氧代戊二酸。为了进一步辅助或改善目的产物的形成，和/或减少或避免否者将减少或降低由该微生物形成的目的产物的实际量或浓度的不希望的副产物或次级产物(通过目的产物的代谢形成)的形成，根据需要，可以失调涉及该谷氨酸或葡萄糖代谢的一种或多种，例如2、3、4或5种个体酶。尤其是,该代谢谷氨酸和/或葡萄糖的重组菌选自埃希氏菌属(Escherichia)的细菌，例如大肠杆菌，如菌株大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RIL菌株(Stratgene)。还可以去除负责氯霉素抗性的CodonPlus质粒。在本专利技术的方法的具体实施方案中，该2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶系统包含2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶(E.C.4.2. I.)和任选包含该酶的激活蛋白(如果为诱导和/或维持预期的脱水酶活性所需)。该激活蛋白可以为建立脱水酶活性所需。根据本专利技术，该酶和蛋白质(戊烯二酸辅酶A转移酶、2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶、激活蛋白、2-羟基戊二酸脱氢酶)具有原核或真核来源。尤其是，它们可以源自不同的微生物属或菌株。例如，并非绝对要求用于建立脱水酶活性的脱水酶和激活蛋白源本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.01.15 EP 09150669.11.用于产生通式I的不饱和二羧酸化合物的生物催化方法 HOOC-CH = CH-X-COOH(I) 其中 X代表直链或支链、任选不饱和、任选取代的烃基； 该方法包括 任选在存在辅酶A源的情况下，在共表达编码戊烯二酸辅酶A转移酶(E. C. 2. 8. 3. 12)和2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶系统的基因的重组微生物中转化通式III的2-羟基取代的二羧酸化合物，以便形成所述式I的化合物HOOC-C (OH) H-CH2-X-COOH (III) 其中 X如上文所定义； 和任选以基本上纯的立体异构体的形式或作为立体异构体的混合物分离所述式I的化合物。2.权利要求I的方法，其中X选自η是从I至4的整数的(CH上、CH= CH、CH2-C(=O)或 CH = C (OH)。3.权利要求I或2的方法，其中由所述重组微生物通过2-羟基戊二酸脱氢酶(E. C. I. I. I.-)催化的式II的2-氧代-二羧酸化合物的转化形成所述2-羟基取代的二羧酸 III HOOC-C ( = O) -CH2-X-COOH (II) 其中 X定义于上文。4.权利要求3的方法，其中所述重组微生物共表达所述2-羟基戊二酸脱氢酶的基因。5.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述式II的氧代-二羧酸化合物加至所述重组微生物或通过所述重组微生物发酵性产生所述式II的氧代-二羧酸化合物。6.权利要求5的方法，其中所述微生物是代谢谷氨酸和/或葡萄糖的需氧菌或厌氧菌，且其中所述式II的化合物是2-氧代戊二酸。7.权利要求6的方法，其中所述代谢谷氨酸和/或葡萄糖的重组菌选自埃希氏菌属。8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶系统包含2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶(E. C. 4. 2. I.-)和任选包含所述酶的激活蛋白。9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酶和激活蛋白是原核或真核来源。10.权利要求9的方法，其中所述酶和激活蛋白源自相同或不同的具有转化谷氨酸为戊烯二酸的能力的厌氧菌。11.权利要求10的方法，其中所述厌氧菌选自氨基酸球菌属、梭菌属、梭杆菌属、消化链球菌属的细菌。12.权利要求11的方法，其中所述厌氧菌是发酵氨基酸球菌、共生梭菌、球孢梭菌、包括所有亚种的具核梭杆菌或不解糖消化链球菌。13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述 a)2-羟基戊二酸脱氢酶(HgdH)包含SEQ ID NO 2或16的氨基酸序列、或与该序列具有至少50%同一性的序列；b)戊烯二酸辅酶A转移酶(GctAB)包含SEQID NO :4和/或6、SEQID NO : 18和/或.20...

【专利技术属性】
技术研发人员：O·策尔德尔，W·布克尔，I·久尔杰维奇，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，
类型：发明
国别省市：