本发明专利技术属于猪分子标记制备技术领域，具体涉及一种猪CKM的5’侧翼启动子片段作为猪胴体性状的遗传标记及制备方法与应用。该遗传标记具有序列表SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列。其特征在于该序列的第82bp处分别存在一个A/G和G/A的突变，引起DraIII-RFLP的多态性。利用该遗传标记对大白猪和梅山猪F2代进行了与猪胴体性状的关联分析，检测了含有不同基因型的大白猪和梅山猪肌肉组织中CKM的表达量。本发明专利技术还公开了该遗传标记的分型检测方法，为猪胴体性状分子标记辅助选择提供了新的遗传标记和检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及猪育种与猪的分子标记辅助选择领域，具体涉及一种与猪的胴体性状相关基因CKM 5’侧翼启动子片段的克隆及其作为猪胴体性状遗传标记的应用。
技术介绍
近年来基因组研究的迅速发展，对基因结构和功能研究的不断深入，一类能够在分子水平上以DNA多态性为标记进行遗传分析从而达到识别个体基因型差异的新型选择方法一分子标记辅助选择技术应运而生。分子标记直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织各个发育阶段均可检测到，不受季节环境限制；多态性丰富，数量多；大多数为共显性，能区别纯合体和杂合体。因此，分子标记辅助选择具有高准确性，可用于早期选种，缩 短世代间隔。与常规育种相结合，可大大加快育种进程。单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism, SNP)标记指由基因组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、单碱基插入或缺失等，被公认为是最新的第三代DNA分子标记。根据SNP在基因中的位置可分为基因编码区 SNP(coding-region SNP cSNP)、基因周边 SNP (perigenic SNP，pSNP)以及基因间SNP(intergenic SNP，iSNP)三类。启动子是真核生物基因表达调控的顺式作用元件，含有基因表达调控网络的重要信息，基因表达的强度以及特异性很大程度上决定于它。因此，研究功能基因5’侧翼序列启动子中的SNP可能有更重要的生物学功能，能够影响基因的表达。CKM(creatine kinase, muscle)编码肌酸激酶肌肉特异型同功酶，是哺乳动物细胞内表达的4种肌酸激酶亚型之一，主要在骨骼肌和心肌中大量表达，而且在快肌纤维中的表达量大约是慢肌纤维中的两倍，是肌肉发育和分化的标志(Trask etal. Developmental regulation and tissue-specific expression of the human musclecreatine kinase gene. J Biol Chem. 1988，263 :17142-17149)。同时，CKM 能与肌原纤维的M带相结合，是骨骼肌能量代谢的关键酶之一(Turner et al. A protein that bindsspecifically to the M-Iine of skeletal muscle is identified as the muscleform of creatine kinase. Proc Nati Acad Sci U S A. 1973,70 :702-705 ；Wallimannet al. Function of M—line—bound creatine kinase as intramyofibrilIar ATPregenerator at the receiving end of the phosphoryIcreatine shuttle in muscle. JBiol Chem. 1984,259 :5238-5246)。当体内ATP浓度低而机体又需要能量时，肌酸激酶催化磷酸肌酸将高能磷酸基团转给ADP形成ATP以供给机体能量的需要。当机体利用有氧氧化产生能量合成ATP的浓度增大时，也需要肌酸激酶催化将高能磷酸基团转移给肌酸，保证磷酸肌酸的重新合成。另外，肌酸激酶也是蛋白激酶C的有效底物，是细胞生长信号途径中的重要成分(Lin et al. Regulation of muscle creatine kinase by phosphorylation innormal and diabetic hearts. Cell Mol Life Sci. 2009，66 :135-144)。缺失 CKM 的小鼠表现为异常的肌肉生理和增加的骨骼肌糖原水平(van Deursen et al. Skeletal musclesof mice deficient in muscle creatine kinase lack burst activity. Cell. 1993,74 621-631)。可见，CKM与体内的能量代谢等密切相关，是影响猪胴体等性状的重要功能基因。但迄今为止，还未见猪CKM基因SNP的有关报道，其与猪胴体等性状的关系也未揭示。
技术实现思路
本专利技术目的在于克隆猪CKM基因5’侧翼启动子区特异DNA片段，寻找SNP位点，并建立相应的SNP检测方法，分析其与与猪胴体性状的关系，为猪的胴体性状标记辅助选择提供有用的分子标记。本专利技术通过以下技术方案实现本专利技术获得了大白猪和梅山猪CKM基因5’侧翼启动子区209bp序列，其DNA序列如序列表SEQ IDN0:1(大白猪)和SEQ ID NO :2 (梅山猪)所示，通过对2个猪种的上述序列进行Cluster W比对提供了位于该209bp扩增片段内部的2处核苷酸多态性(SNP)，其 中在所述的序列表SEQ ID NO 1的82bp处存在一个A/G的突变，在序列表SEQ ID NO 2的82bp处存在一个G/A突变，导致DraIII酶切位点的改变，引起DraIII-RFLP多态性。其SNP位点如图I所示。制备该启动子片段的步骤如下所示选择中国地方猪种梅山猪和外来的欧洲大白猪为实验材料，从猪血液中提取基因组DNA，根据猪CKM基因5’侧翼序列设计如下引物正向引物F : 5 ’ AGGAGACAGCGAGTAGCG 3 ’，反向引物R : 5 ’ CCCTGATGCCTGTGCTTA 3 ’。利用该引物进行PCR扩增，PCR产物纯化，克隆测序，序列比对分析。本专利技术提供了检测上述序列82bp处A/G变异的DraIII-RFLP基因型分型方法。本专利技术进一步提供了利用DraIII-RFLP方法确定不同基因型个体与猪胴体性状之间的相关关系的关联分析的应用。进一步利用实时定量PCR技术检测了 CKM基因在含有不同基因型的梅山猪和大白猪中的表达量。序列表附图说明序列表SEQ ID NO :I是外来品种大白猪CKM 5’侧翼启动子片段的核苷酸序列；序列表SEQ ID NO 2是中国地方猪种梅山猪CKM 5’侧翼启动子片段的核苷酸序列；图I :是大白猪和梅山猪CKM 5’侧翼启动子片段的核苷酸序列比对结果和SNP位点图2 :是CKM基因5’侧翼区DraIII-RFLP检测结果琼脂糖浓度为2% ;图中泳道M为DL2000Maker ;泳道I为GG型，209bp ;泳道2为AA基因型，8Ibp，128bp ;泳道3为AG基因型，209bp，81bp，128bp。图3 :是不同基因型的CKM基因的表达量分析。具体实施方式实施例I猪CKM 5’侧翼启动子区特异DNA片段的获得及SNP检测方法的建立选择外来血缘猪“大白猪”和中国地方猪种“梅山猪”两种不同基因型猪品种为试验材料，根据猪CKM基因基因组序列(GeneBank登录号DQ153192)设计如下引物，引物序列如下正向引物F : 5 ’ AGGAGACAGCGAGTAGCG 3 ’，反向引物R : 5 ’ CCCTGATGCCTGTGCTTA3，。用上述引物在大白猪(国外血缘猪)和梅山猪(中国地方猪)基因组DNA中进本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪CKM基因5’侧翼启动子片段作为猪胴体性状的遗传标记，其核苷酸序列如SEQ？IDNO：1和SEQ？ID？NO：2所示，在序列表SEQ？ID？NO：1所示序列的82bp处存在一个A/G的突变，在序列表SEQ？ID？NO：2所示序列的82bp处存在一个G/A突变，导致DraIII酶切位点的改变，引起DraIII？RFLP多态性。
【技术特征摘要】
1.猪CKM基因5’侧翼启动子片段作为猪胴体性状的遗传标记，其核苷酸序列如SEQIDNO 1和SEQ ID NO 2所示，在序列表SEQ ID NO 1所示序列的82bp处存在一个A/G的突变，在序列表SEQ ID NO 2所示序列的82bp处存在一个G/A突变，导致DraIII酶切位点的改变，引起DraIII-RFLP多态性。2.根据权利要求I所述的遗传标记，克隆猪CKM基因5’侧翼启动子片段所用引物的DNA序列如下所示正向引物 F : 5 ’ AGGAGACAGCGAGTAGCG 3，， 反向引物 R :5’ CCCTGATGCCTGTGCTTA 3，。3...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐德全，孙小瑞，刘敏，熊远著，邓昌彦，蒋思文，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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