本发明专利技术涉及一种改进的酮还原酶多肽，该改进的酮还原酶多肽的酶活性高于野生型酮还原酶多肽的酶活性；所述酶活性是指催化酮类化合物发生还原反应生成手性醇的酶活性；所述野生型酮还原酶多肽具有SEQ?ID?No.2所示氨基酸序列，且来源于高加索乳酸杆菌Lactobacillus?kefiri?DSM?20587；所述改进的酮还原酶多肽包含与SEQ?ID?No.2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且该改进的酮还原酶多肽的氨基酸序列中对应于SEQ?ID?No.2所示氨基酸序列中的第94位残基为酪氨酸残基。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种改进的酮还原酶多肽、其编码基因以及表达该多肽的细胞。
技术介绍
去氧肾上腺素(phenyl印hrine)又名苯肾上腺素，其化学学名为3_ (2- (N-甲基氨基)-1-羟基)苯酚。它在临床上常用于阵发性室上性心动过速，可通过收缩血管，升高血压使迷走神经反射的兴奋而心率减慢。去氧肾上腺素的合成方法包括化学法和生物法，将其酮底物立体选择性还原成具有手性结构的产物。采用生物法制备去氧肾上腺素需要使用具有立体选择性的酮还原酶。 然而，现有的野生型酮还原酶KRED，其催化活性很低，例如，10g/l粗酶粉20小时只能完全转化lg/1的酮底物，无法满足工业化生产的需要。目前对于去氧肾上腺素的生物制备，还没有一种既具有一定立体选择性，又具有较好催化活性的酮还原酶。
技术实现思路
本专利技术一方面提供了一种该改进的酮还原酶多肽的酶活性高于野生型酮还原酶多肽的酶活性；所述酶活性是指催化酮类化合物发生还原反应生成手性醇的酶活性；所述野生型酮还原酶多肽具有SEQ ID No. 2所示氨基酸序列，且来源于高加索乳酸杆菌 Lactobacillus kef iri DSM 20587 ；所述改进的酮还原酶多肽包含与SEQ ID No. 2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且该改进的酮还原酶多肽的氨基酸序列中对应于SEQID No. 2所示氨基酸序列中的第94位残基为酪氨酸残基。在本专利技术的一个具体实施方案中，所述酶活性是指催化底物1-(3-羟基苯基)-2_[甲基(苯基甲基)氨基]乙酮发生还原反应生成3- ((R)-2- (N-苄基-N-甲基氨基)-I-羟基)的酶活性。3- ((R) -2- (N-苄基-N-甲基氨基)-I-羟基)的酶活性经过还原反应脱去苄基后生成去氧肾上腺素。在本专利技术的一个具体实施方案中，所述改进的酮还原酶多肽具有如SEQ IDNo. 4所示氨基酸序列。在本专利技术的一个具体实施方案中，该改进的酮还原酶多肽的酶活性是所述野生型酮还原酶多肽的酶活性的至少2倍。本专利技术另一方面还提供了编码上述改进的酮还原酶多肽的基因，其包含与SEQ IDNo. I所示核苷酸序列有至少90%序列同源性的核苷酸序列。在本专利技术的一个具体实施方案中，该基因具有如SEQ ID No. 3所不核苷酸序列。本专利技术再一方面还提供了一种细胞，该细胞表达上述的改进的酮还原酶多肽。优选的，所述细胞属于乳酸杆菌或大肠杆菌。更优选的，所述乳酸杆菌属于高加索乳酸杆菌。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述大肠杆菌为E. coli. BL21 (DE3)。具体实施例方式下面将通过实施例对本专利技术的
技术实现思路
作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本专利技术的内容。因此，所举的例子并不限制本专利技术的保护范围。实施例I一、制备能够表达如SEQ ID No. 4所示氨基酸序列的改进的酮还原酶多肽的宿主细胞步骤I :全基因合成如SEQ ID No. I所示核苷酸序列步骤2 :引入对第94位氨基酸的饱和突变为了将饱和突变引入SEQ ID No. I所示核苷酸序列，我们以含有SEQ ID No. I所示核苷酸序列的质粒pET21b-KREDlk作为PCR反应模板，并设计了以下两对引物上游引物Fl: 5，-AGGGCTGCATATGACTGATCGTTTAAAACAC-3’ (SEQ ID No. 5)下游引物Rl: 5’ -CTCAAGCTTTTATTGAGCAGTGTATCCACC-3，(SEQ ID No. 6)上游引物Fl和下游引物Rl序列中标注下划线处表示酶切位点突夺引物F2:5’ -CAATGCCGGAAGTNNSGTCCTCAAGAG-3，(SEQ ID No. 7)突夺引物R2:5’ -CTCTTGAGGACSNNACTTCCGGCATTG-3，(SEQ IDNo. 8)突变引物F2和突变引物R2序列中标注下划线处表示突变位点的简并碱基以质粒PET21b_KREDlk为模板，进行第一轮PCR反应，按以下次序，将各成分在灭菌 EP 管中混合，采用 25 u I 反应体系ddH20 16. 3 u I, PCR Buffer 2. 5u I, dNTP 2u I,引物 Fl(10iimol/L)2ii 1，$*R2(10iimol/L)2iil，pET21b-KREDlk I u I, Pfu DNA 聚合酶(5U/u 1)0. 2 u I。扩增条件为94°C 2min, 一个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 20s, 30 个循环；72°C，lOmin，一个循环。将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收在300bp处的特异性条带，使用博大泰克DNA片段快速回收试剂盒进行回收。然后进行第二轮PCR反应，反应体系为ddH20 16. 3 u I, PCR Buffer 2. 5u I, dNTP 2u I,引物 F2 (10 y mol/L)2u I,引物 Rl(10iimol/L)2ii l，pET21b-KREDlk I u I, Pfu DNA 聚合酶 0. 2 y I。扩增条件为94°C 2min，一个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s，30 个循环；72°C，lOmin，一个循环。将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收在500bp左右的特异性条带。然后，以 前二轮PCR的产物为模板，进行第三轮PCR，反应体系如下ddH20 14. 3 u I, PCR Buffer2. 5 iil, dNTP 2 iil, $*Fl(10iimol/L)2iil,引物 Rl (10 y mol/L) 2 y 1，第一轮 PCR 回收产物Iu 1，第二轮PCR回收产物I iil，Pfu DNA聚合酶0. 2iil。扩增条件为94°C 2min，一个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 50s，30个循环；72°C，lOmin，一个循环。将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收在SOObp左右的特异性条带。该片段中则包含了具有饱和突变的所有突变序列。步骤3 :构建突变核苷酸序列的表达载体在含有氨苄青霉素(Amp，100 U g/ml)的LB培养基中接种含有质粒pET21b的大肠杆菌ToplO菌株，于37°C摇床中培养过夜。取3ml菌液转入EP管中，12000rpm离心lmin，收集菌体，根据博大泰克小量质粒制备试剂盒说明书操作提取pET21b质粒。酶切质粒pET21b 的反应体系为NEB Buffer 25 u I, pET21b 43 u I1NdeIIu I1Hind III I yl，于37°C水浴中保温4h。然后酶切步骤2获得的突变后的基因片段，依次加入如下试剂NEB Buffer25u I,基因片段 43 yl, NdeI Iu I1Hind III lyl，于 37°C水浴中保温4h。随后向两个反应体系中分别加入IOii 16*loading buffer,进行凝胶电泳检测，胶回收被切成线性的DNA分子。在EP 管中分别加入 H2O 3. 5 u I, T41igase Buffer Iu I, pET21b (Ndel, HindIIIdigested) 2u I,步骤3所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种改进的酮还原酶多肽，其特征在于，该改进的酮还原酶多肽的酶活性高于野生型酮还原酶多肽的酶活性；所述酶活性是指催化酮类化合物发生还原反应生成手性醇的酶活性；所述野生型酮还原酶多肽具有SEQ？ID？No.2所示氨基酸序列，且来源于高加索乳酸杆菌Lactobacillus？kefiri？DSM？20587；所述改进的酮还原酶多肽包含与SEQ？ID？No.2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且该改进的酮还原酶多肽的氨基酸序列中对应于SEQ？ID？No.2所示氨基酸序列中的第94位残基为酪氨酸残基。
【技术特征摘要】
1.一种改进的酮还原酶多肽，其特征在于， 该改进的酮还原酶多肽的酶活性高于野生型酮还原酶多肽的酶活性； 所述酶活性是指催化酮类化合物发生还原反应生成手性醇的酶活性； 所述野生型酮还原酶多肽具有SEQ ID No. 2所示氨基酸序列，且来源于高加索乳酸杆菌 Lactobacillus kefiri DSM 20587 ； 所述改进的酮还原酶多肽包含与SEQ ID No. 2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且该改进的酮还原酶多肽的氨基酸序列中对应于SEQ ID No. 2所示氨基酸序列中的第94位残基为酪氨酸残基。2.如权利要求I所述的改进的酮还原酶多肽，其特征在于所述酶活性是指催化底物I-(3-羟基苯基)-2-[甲基(苯基甲基)氨基]乙酮发生还原反应生成3-((R)-2-(N-苄基-N-甲基氨基)-I-羟基)的酶活性。3.如权利要求I所述的改进的酮还原酶多肽...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭浩，王娟，孙勇，王波，文军，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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