利用获取光的多发色团检测和分析多核苷酸的方法和组合物技术

本本发明专利技术涉及利用获取光的多发色团检测和分析多核苷酸的方法和组合物。使被怀疑含有目标多核苷酸的样品与聚阳离子多发色团和互补于目标多核苷酸的传感PNA接触。该传感PNA包含信号传递发色团，可吸收来源自受激发多发色团的能量，并在目标多核苷酸的存在条件下发射光。本发明专利技术方法可以多路形式应用。本发明专利技术也提供了包含可实现上述方法的试剂的试剂盒。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测和分析样品中多核苷酸的方法、物品和组合物。
技术介绍
可实现DNA序列实时检测且灵敏度高的方法具有重大的学术和经济利益。u’3其应用包括医学诊断、遗传突变的鉴定、基因送递监控和特定基因组技术。4阳离子有机染料，如溴化乙锭和噻唑橙被插入双链DNA (ds DNA)的沟槽中，并充当直接DNA杂交探针时，便可激发，但缺乏序列特异性。5’6用于链特异性测定的能量/电子转移发色团对是存在的，但需要化学标记两个核酸，或双重修饰相同的改变链(例如，分子信标)。7’8标记两个DNA位点的困难导致了低产率、高成本，并生成了单个标记的杂质，从而使检测灵敏度较低。9最近，有关肽核酸(PNAs)的介绍提供了新的研究和诊断应用方面的契机。1(l’n在PNA中，DNA中带负电荷的磷酸键被肽模拟物中性酰胺键取代。与类似的DNA/DNA复合体相t匕，PNA/DNA复合体的形成更为快速，结合能更高，特异性也更高。12这些特性之所以被增强，是因为缺乏在带负电荷的DNA双链之间所存在的库伦排斥。PNA复合体具有更高的热稳定性，这是因为其主链对核酸酶、蛋白酶和肽酶生物降解的敏感性降低了。13’14另外，PNA复合体在杂交期间对离子强度和PH通常不敏感，从而为DNA检测提供了更为宽广的平台。18因此本领域需要检测和分析样品中特定多核苷酸的方法，以及在这些方法中有用的组合物和物品。
技术实现思路
本专利技术提供了用于检测和分析样品中目标多核苷酸的方法、组合物和物品。将怀疑含有目标多核苷酸的样品与聚阳离子多发色团和传感肽核酸(PM)接触，其中传感肽核酸与目标多核苷酸互补。使传感PNA与信号传递发色团缀合。无需受理论约束，样品中存在目标多核苷酸时，认为通过利用与目标多核苷酸主链的静电相互作用，信号传递发色团被带入邻近阳离子多发色团的近程，其中目标多核苷酸已与传感PNA杂交(见图I)。随后，信号传递发色团可从已激发的聚阳离子多发色团获得能量，并发射可检测的光。目标多核苷酸天然存在于样品中时，可对其进行分析，或者可以在分析之前或分析的同时将其扩增。本专利技术提供了包含用于实现本专利技术方法的试剂的溶液，也提供了含有该试剂的试剂盒。本专利技术方法可用于多路设置，其中采用了多种不同传感PNA分析多种不同目标多核苷酸。本专利技术方法可任选在特定表面上进行，例如采用可与表面缔合的聚阳离子多发色团；该表面可以是传感器。本专利技术方法也可以均相形式被提供。检测多核苷酸的其它技术均可将此处所描述的方法和物品作为选择方案。附图说明图I表示了本专利技术方法，采用聚阳离子聚合物作为获取光的多发色团。提供了传感PNA(PNA-O)，包含信号传递发色团，并具有与所关心目标多核苷酸互补的碱基序列。在与样品中目标多核苷酸接触时，由于与目标多核苷酸存在静电相互作用，聚阳离子多发色团被带入邻近信号传递发色团的近程。随后，多发色团的激发使信号传递发色团发射光。图2所示分别为聚合物I (见下文)和传感肽核酸PNA-C* 的吸收(绿色和橙色)和发射(蓝色和红色)光谱。对聚合物I和PNA-C*的激发分别在380和480nm处进行。图3所示为通过聚合物I的激发，在互补(红色)和非互补(黑色)DNA存在条件下的PNA-C*发射光谱。将PNA-C*和相应的DNA —起加入pH = 5. 5的水中。该光谱相对于聚合物I的发射被标准化。图4所示为通过寡聚体2的激发，在互补(红色)和非互补(黑色)DNA存在条件下的PNA-C*发射光谱。将PNA-C*和相应的DNA —起加入pH = 5. 5的水中。该光谱相对于寡聚物2的发射被标准化。具体实施例方式目前，有关DNA和RNA传感器(包括“基因-芯片”和“DNA-芯片”)的技术均基于荧光标记(发光团)与DNA单链的共价附着。这些传感器中的大部分均不得不依赖于被分析样品的标记，由于样品间标记反应的效率变化导致了若干不可避免的难题，因而需要复杂的交叉校准。其它系统则依赖于“分子信标”方法，需要附着发光团并准确对工程改造序列淬灭。本专利技术的一种方法包括使样品与主要为水性的溶液中的至少两种组分接触(a)获取光、发光的多发色团系统，例如共轭聚合物，半导体量子点或水溶性树枝状结构；和(b)与发光信号传递发色团或“PNA-C*”缀合的传感PNA。在多发色团激发时，具有信号传递发色团-C*的特征性光波长的发射说明溶液中存在目标多核苷酸。通过利用分别具有不同碱基序列和不同信号传递发色团(PNA1-C1^PNA2-C2*、PNA3-C3*、PNA4-C4*等)的多种不同传感PNA，可独立检测并分析多种不同多核苷酸。本专利技术所选择的获取光的发色团和信号传递发色团(C*)可使两个发色团的吸收条带的重叠程度最小，并使两种发色团的发光发射光谱的波长不同。当在水性溶液中制备时，获取光的发光多发色团系统带正电荷或阳离子，优选聚阳离子(例如与聚电解质结合的聚阳离子)。由于传感PNA不带电荷，因此，在传感PNA与获取光的阳离子发光多发色团系统之间存在的库伦相互作用最小。在加入与传感PNA序列互补的目标多核苷酸时，目标多核苷酸与该传感PNA杂交。由于目标多核苷酸带负电荷，传感PNA与聚阳离子多发色团缔合，使能量从聚阳离子多发色团转移至信号传递发色团，例如，经由F6rs ter能量转移机制。当加入碱基序列与传感PNA的碱基序列不互补的多核苷酸时，碱基对杂交不发生，多发色团与传感PNA之间静电介导的络合作用也不出现。在不发生上述杂交的情况下，聚阳离子多发色团与信号传递发色团之间的平均距离对有效能量转移而言由于过大，使信号传递发色团很少或无发射。上述总体方案可用于检测受检溶液中目标多核苷酸的存在。另外，PNA通过结合并插入ds DNA和置换相同序列的DNA链，从而具有了形成三重结构的能力。15’16’17上述传感PNA/聚阳离子多发色团平台可被掺入用于直接检测ds DNA的系统中。18除已描述方法外，本专利技术也提供了一种包含至少两种下述组分，且主要为水性的溶液；(a)阳离子多发色团，和(b) “传感PNA”(PNA-C*)，包括与信号传递发色团缀合的肽核酸。如实施例所例证的，可利用由水溶性多发色团，如共轭聚合物提供的光学放大，检测与PNA传感器杂交的多核苷酸。通过利用较高分子量的水溶性共轭聚合物或其它结构，如此处所描述的聚阳离子多发色团可增强上述放大。本专利技术可以 均相形式被提供，即利用荧光检测法提供的方便，并利用在PNA-INA相互作用中发现的增强的杂交情况。本专利技术可被用于检测扩增的目标多核苷酸，或者在独立试验中由于信号放大程度大，从而无需扩增多核苷酸。因此，本专利技术超越现有基因芯片技术的独特优势包括，避免了在分析之前，通过将发光团或发色团共价偶联至样品中所含或样品来源的多核苷酸，对待分析各样品进行首次标记的需要。上述偶联方法在偶联效率的再现性方面存在固有困难，因而需要样品间的交叉校准。此处描述的本专利技术对可用于检测样品是否存在目标多核苷酸的任何试验均有用。典型的试验包括测定样品中目标多核苷酸的存在或其相对量，或者该试验可定量或半定量。本专利技术的方法均可以多路形式进行。可采用多种不同传感PNA，并通过利用与相应的传感PNA缀合的不同信号传递发色团，检测样品中相应的不同目标多核苷酸。本专利技术提供的多路方法应用了 2、3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定方法，包括：提供被怀疑含有目标多核苷酸的样品；提供可与目标多核苷酸发生静电相互作用，并在激发可将能量转移至信号传递传递发色团的聚阳离子多发色团；提供单链形式并与目标多核苷酸互补的传感肽核酸(PNA)，该传感PNA与信号传递发色团缀合；使样品在特定条件下与溶液中的传感PNA和多发色团接触，其中在上述条件下，如果存在目标多核苷酸，传感PNA可与其杂交；向上述溶液施加可激发多发色团的光源；并检测是否由信号传递发色团发射光。

【技术特征摘要】
2002.06.20 US 60/390524;2002.08.26 US 60/4062661.一种测定方法，包括 提供被怀疑含有目标多核苷酸的样品； 提供可与目标多核苷酸发生静电相互作用，并在激发可将能量转移至信号传递传递发色团的聚阳离子多发色团； 提供单链形式并与目标多核苷酸互补的传感肽核酸(PM)，该传感PNA与信号传递发色团缀合； 使样品在特定条件下与溶液中的传感PNA和多发色团接触，其中在上述条件下，如果存在目标多核苷酸，传感PNA可与其杂交； 向上述溶液施加可激发多发色团的光源；并 检测是否由信号传递发色团发射光。2.权利要求I的方法，其中多发色团包括选自饱和聚合物、共轭聚合物、树枝状聚合物和半导体纳米晶体的结构。3.权利要求2的方法，其中多发色团包括饱和聚合物。4.权利要求2的方法，其中多发色团包括树枝状聚合物。5.权利要求2的方法，其中多发色团包括半导体纳米晶体。6.权利要求2的方法，其中多发色团包括共轭聚合物。7.权利要求6的方法，其中共轭聚合物具有如下结构8.权利要求6的方法，其中共轭聚合物具有如下结构9.权利要求I的方法，其中样品与配比大约为I: I的传感PNA和多发色团接触。10.权利要求I的方法，其中样品在足量有机溶剂的存在条件下，与传感PNA和多发色团接触，上述有机溶剂的量足以降低传感PNA与多发色团之间的疏水相互作用。11.权利要求I的方法，其中样品与具有相应不同序列的多种不同传感PNA接触，该不同传感PNA包含相应的不同信号传递发色团，其中上述不同传感PNA中的每一个均可与相应的不同目标多核苷酸选择性地杂交。12.权利要求I的方法，其中发色团为荧光团。13.权利要求12的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：GC巴赞，BS盖洛德，
申请(专利权)人：加州大学评议会，
类型：发明
国别省市：