带有氯化氨基酸的胰岛素类似物制造技术

一种胰岛素类似物包含掺入了氯化苯丙氨酸的B链多肽。氯化苯丙氨酸可位于B24位。氯化苯丙氨酸可为对单氯苯丙氨酸。该类似物可属于哺乳动物胰岛素，例如人胰岛素。一种核酸编码所述胰岛素类似物。氯化胰岛素类似物保留重要的活性。一种治疗患者的方法，包括将生理学上有效量的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐给予患者。基于氯取代的胰岛素稳定可降低原纤化，因而增强在缺乏冷藏的发展中世界的地区中对糖尿病的治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抵抗热降解的多肽。更具体地，本专利技术涉及热稳定的胰岛素类似物。甚至更具体地，本专利技术涉及通过在其氨基酸中掺入氯元素而化学和热稳定的胰岛素类似物。氯被分类为卤素，因其原子半径、电负性、局部电荷的立体电子分布和对分子中邻近原子的立体电子特性的传送效应而区别于蛋白质中的一般組成。
技术介绍
超稳定蛋白质(包括治疗剂和疫苗)工程在无法连续获得电和冷藏的发展中世界的地区可能具有广泛的社会效益。胰岛素提供了易于热降解的治疗性蛋白质的实例。非洲和亚洲糖尿病的即将来临的流行加深了因胰岛素的化学和物理降解而致的挑战。因为胰岛素类似物的化学降解速率与其相对稳定性反相关，所以超稳定制剂的设计可提高所述挑战区域内胰岛素代替疗法的安全性和功效。小有机分子中一些卤素取代的效用在药物化学中已知。氟化官能团对治疗中广泛采用的小分子的功效至关重要，所述小分子为例如胆固醇生物合成抑制剂阿托伐他汀(Liptor )以及用于治疗抑郁和其它情感障碍的选择性血清素再吸收抑制剂盐酸氟西汀(Prozac ) 0虽然氟原子半径与氢原子半径相似，但其巨大的诱导效应改变了这些药物的立体电子特性，进而增强药物的生物学活性。物理有机化学的类似考虑涉及更大的卤素原子例如氯的掺入。小分子孟鲁司特钠irnmtelukast sodium) (Singulair )是白细胞三烯抑制剂，通过共价掺入氯原子来增强其药学特性。另外，2009年7月31日提交的国际专利申请号PCT/US2009/52477提供了胰岛素类似物中氟取代氨基酸的用途。与掺入氟原子的上述效应相比，在科学文献中较少良好表征通过位点特异性掺入 氯原子到修饰的氨基酸中来调整蛋白质的化学、物理和生物特性。芳族侧链可參与许多种弱极性相互作用，其不但涉及邻近芳环，而且还涉及正或负静电势的其它来源。实例包括肽键中的主链羰基和酰胺基。胰岛素给药早已建立为糖尿病的治疗。胰岛素是小的球状蛋白质，在脊椎动物的新陈代谢中起着重要作用。胰岛素含有两条链，其中A链含有21个残基，B链含有30个残基。该激素以Zn2+稳定的六聚体储存于胰￠-细胞中，但在血流中以无Zn2+的単体发挥作用。胰岛素是单链前体胰岛素原的产物，在胰岛素原中连接区(35个残基)将B链的C-末端残基(残基B30)连接到A链的N-末端残基上(附图说明图1A)。虽然尚未測定胰岛素原的结构，但许多证据表明其由胰岛素样的核心和无序的连接肽组成(图1B)。认为在糙面内质网(ER)中三个特异性ニ硫键(A6-A11、A7-B7和A20-B19，图IA和1B)的形成与胰岛素原的氧化折叠偶联。从ER中输出到高尔基体后，胰岛素原即刻装配形成Zn2+配位的可溶性六聚体。内切蛋白酶解消化及转化为胰岛素发生在未成熟的分泌颗粒中，接着发生形态学凝聚。已通过电镜学(EM)观察到成熟贮藏粒中锌胰岛素六聚体的晶体阵列。已对Zn2+配位的胰岛素六聚体，即生理学上的储存形式，进行了大量X-射线晶体学研究。在体外已阐述了多种晶形，定义了三个结构家族，命名*T6、T3Rf3和R6。在这些六聚体中，认为两个Zn离子位于沿六聚体中心轴的位置，每ー个Zn离子被三个组氨酸(HisBlO)配位；在ー些晶形中观察到另外的低亲和カ的Zn结合位点。T态原体类似于溶液中胰岛素单体的结构。R态原体在B链的ニ级结构上表现出变化中央a-螺旋延伸至BI (R态)或至B3 (扰乱的Rf态)。胰岛素在血流中以单体发挥作用，但认为正是单体对原纤化和化学降解的大部分形式最为敏感。通过NMR在溶液中表征的胰岛素单体的结构见图ID15A链由N-末端a -螺旋 (残基A1-A8)、不规则转角(A9-A12)、第二个a-螺旋(A12-A18)和C-末端延伸(A19-A21)组成。B链含有N-末端臂(B1-B6)、ト转角(B7-B10)、中间a -螺旋(B9-B19)、ト转角(B20-B23)、P -链(B24-B28)和柔性C-末端残基B29-B30。两条链包装形成通过三个ニ硫键(胱氨酸A6-A11、A7-B7和A20-B19)来稳定的致密球状结构域。普通胰岛素的吸收受限于Zn-胰岛素六聚体的动力学寿命，为使胰岛素能通过毛细血管内皮层运输，需要六聚体分解为更小的ニ聚体和単体。隐含在Humalog 和Novolog 设计下的基本想法是加速分解。这通过使典型的ニ聚体形成表面(C-末端反向平行￠-折叠)失稳来完成。Humalog 含有ProB28 — Lys和LysB29 — Pro取代，即模拟IGF-1序列的倒位。Novolog 含有ProB28 — Asp取代。虽然取代削弱ニ聚化作用，但类似物有能カ组装苯酚或间甲酚稳定的锌六聚体。这种组装保护类似物在小瓶中不会原纤化，但在皮下注射之后，六聚体随苯酚(或间甲酚)和锌离子扩散开而迅速离解。这些类似物的不稳定性是由患者或医疗保健提供者稀释后其储存期限缩短的原因。对于胰岛素类似物而言，在保留HumaIog 的变体ニ聚体相关的P -折叠的同时，增加胰岛素单体的内在稳定性将会有益。已知在储存期间锌胰岛素六聚体的用途，其代表着延缓小瓶或泵贮器中制剂的物理降解和化学降解的经典策略。因为锌胰岛素六聚体太大以致不能立刻进入毛细血管，所以皮下注射后胰岛素的吸收速率受限于六聚体离解为更小的ニ聚体和单体单元所需的时间。因此，以下胰岛素类似物是有利的，其既(a)能允许六聚体在高蛋白质浓度下(如在小瓶或泵中)组装，但又(b)在ニ聚体界面下充分地去稳定以表现出加速分解，由此预测从皮下储库中超速吸收。这些结构目标是在稳定性(储存中)和不稳定性(注射后)之间找到平衡。已研究了胰岛素中的氨基酸取代对热力学稳定性和生物学活性的影响。没有观察到稳定性和活性之间有一致的关联。尽管ー些增强热力学稳定性的取代也增强与胰岛素受体的结合，但是其它增强稳定性的取代却阻碍所述结合。在野生型人胰岛素中已研究了用数个其它氨基酸取代Th/8的影响，报道了 B链中含有三个不相关取代(HisB1° — Asp、Ptob28 — Lys和LysB29 — Pro)的工程改造的胰岛素単体。加速或延缓吸收时程的取代实例亦为本领域所知。所述取代(例如Novalog 中的AspB28和Humalog 中的[LysB28，ProB29])可与并通常与更迅速的原纤化和更差的物理稳定性相关。实际上，在ー项研究中，测试了一系列十种人胰岛素类似物对原纤化的敏感性，包括Aspb28-胰岛素和Aspbici-胰岛素。发现十种全部在pH 7. 4和37°C下都比人胰岛素对原纤化更敏感。十种取代位于胰岛素分子中的不同部位，很可能与典型热力学稳定性的多种变化有夫。虽然已观察到一系列效应，但活性和热力学稳定性之间不存在相关性。胰岛素是小的球状蛋白质，非常容易化学合成和半合成，这有利于掺入非标准侧链。胰岛素含有三个苯丙氨酸残基(BI、B24和B25位)和在B26位的结构相似的酪氨酸。在脊椎动物胰岛素和胰岛素样生长因子中保守的PheB24芳环紧靠着疏水核组装(但并不在核内)以稳定B链的超ニ级结构。PheB24位于典型的受体结合表面，已提出将其针对受体结合指导在构象方面的改变。PheB25凸出于胰岛素単体表面，而TyrB26在核的一个边缘邻近脂族侧链(IleA2、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.11 US 61/285,9551.ー种包含掺入了氯化苯丙氨酸的B链多肽的胰岛素类似物。2.权利要求I的胰岛素类似物，其中所述氯化苯丙氨酸位于B24位。3.权利要求2的胰岛素类似物，其中所述氯化苯丙氨酸为对单氯苯丙氨酸。4.权利要求1-3中任一项的胰岛素类似物，其中所述类似物为哺乳动物胰岛素的类似物。5.权利要求4的胰岛素类似物，其中所述类似物为人胰岛素的类似物。6.权利要求4的胰岛素类似物，其中所述B链多肽包含选自SEQ.ID. NO. 4_8和其具有三个或更少的另外氨基酸取代的多肽的氨基酸序列。7.ー种编码权利要求4的胰岛素类似物的核酸。8.权利要求6的核酸，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：M维斯，
申请(专利权)人：卡斯西部储备大学，
类型：发明
国别省市：