本发明专利技术提供了人前列腺凋亡反应蛋白4(Par4)或其选择性凋亡癌细胞区(SAC)，与凋亡素2配体(Apo2L)融合的蛋白，即Par4-Apo2L、SAC-Apo2L融合蛋白，以及编码这些蛋白的DNA序列，含编码这些DNA序列的载体，含这些载体的宿主细胞，用基因工程制备这些蛋白的方法，以及含这些蛋白的药物组合物。本发明专利技术的Par4或SAC、Apo2L具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，所以融合蛋白可以用于制备治疗如肿瘤等疾病的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及DNA重组技术和生物技术药物领域。更具体地，本专利技术涉及人前列腺凋亡反应蛋白4(Par4)或其选择性凋亡癌细胞区(SAC)，与凋亡素2配体(Apo2L)融合的蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在如肿瘤等疾病治疗中的应用。
技术介绍
Par4是1994年由Sells等人用差示杂交法，从凋亡的前列腺癌细胞中首次分离到的凋亡诱导基因，因此命名为前列腺凋亡反应蛋白4(Prostate apoptosis response 4protein, Par4) 。Par4 基因位于人类染色体 12q21. 2上，有7个外显子和6个内含子组成，编码序列有1023个核苷酸(SEQ ID NO. 1)，编码的Par4蛋白质由340aa组成(SEQ ID NO. 2)。现国际上将Par4统一命名为PAWR(PRKC，apoptosis, WTl, regulator)，在各大生物数据库中的 ID 为HGNC :8614 ；Entrez Gene 5074 ；Ensembl ENSG00000177425 ；UniProtKB :Q96IZ0。在蛋白质缺失突变分析中发现，人Par4的145-203aa组成的59个氨基酸，为其发挥细胞凋亡作用的核心活性区域，即构成了人Par4诱导凋亡的最小功能域。这个核心区域是Par4进入细胞核、FasL/Fas定位于细胞膜、活化Fas促凋亡通路、抑制NF-K B活性等诱导凋亡的必要及充分的条件。该区域不仅能够定位于肿瘤细胞的细胞核，也能定位于正常及永生细胞的细胞核，但却只选择性地诱导肿瘤细胞的凋亡。这说明Par4诱导细胞凋亡是由这个核心区域实现的。由于这个核心区域在正常细胞中并不诱导凋亡，但却能够诱导各种肿瘤细胞凋亡，因此称为选择性凋亡癌细胞区(selective for apoptosis induction cancer cells domain, SAC)。Par4 与 SAC也可在细胞外，发挥选择性诱导癌细胞凋亡的作用1995年，国外报道从人表达标签序列文库(expressed sequence tag, EST)中筛选到一种编码抗肿瘤蛋白质的基因，该基因编码的蛋白质称为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL),又称凋亡素2配体(apoptotin-2 ligand, Apo2L),其通过启动细胞固有的凋亡程序,可有效地诱导肿瘤和转化细胞凋亡，而对正常细胞无影响。现国际上将Apo2L统一命名为肿瘤坏死因子(配体)超家方矣成员 10 ,在各大生物数据库中的 ID 为HGNC :11925 ；Entrez Gene :8743 ；Ensembl ENSG00000121858 ；UniProtKB :P50591。人Apo2L基因的编码序列有846个核苷酸(SEQ ID NO. 3)，编码的Apo2L蛋白质由281个氨基酸组成(SEQ ID NO. 4)。业已证明Apo2L是典型的II型跨膜蛋白，其N-端第95或114位开始的胞外区可形成游离的可溶性凋亡素2配体蛋白，同样具有特异启动肿瘤凋亡作用。由于Par4与Apo2L对诱导肿瘤凋亡作用在不同的环节，用合适的氨基酸连接臂使两者融合表达，由此所产生的重组融合蛋白质既可以通过Par4选择性诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤，还可以通过Apo2L特异启动肿瘤细胞固有的凋亡程序而抗肿瘤。因此，本专利技术所得到的融合蛋白质可以在两者的协同下增强抗肿瘤的效果，还可减少两者分别给药给患者所带来的麻烦和痛苦，为抗肿瘤等疾病的治疗提供新的药物或制剂。因此，本领域迫切需要开发新的具有Par4和Apo2L两者生物活性的药物。此外，本领域还迫切需要开发成本低廉和/或步骤简便的生产工艺。
技术实现思路
本专利技术的一个目的就是提供一种新的具有Par4和Apo2L生物活性的药物，它是Par4或其活性片段SAC和Apo2L的融合蛋白。本专利技术的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。本专利技术的另一目的是提供一种成本低廉和\或步骤简便的生产所述Par4或SAC 和Apo2L融合蛋白的方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种融合蛋白，它包括(a)人前列腺凋亡反应蛋白4(Par4)元件,该元件具有人Par4或其活性片段SAC的氨基酸序列；(b)人凋亡素2配体(Apo2L)元件，该元件具有人Apo2L或其活性片段的氨基酸序列；以及(C)位于人Par4元件和Apo2L元件之间的0_20个氨基酸的连接序列。更佳的，所述的Par4元件具有SEQ ID NO. 2中第1-340位或145-203位的氨基酸序列；所述的Apo2L元件具有SEQ ID NO. 4中第95-281位或114-281位的氨基酸序列；而且，所述的连接序列为含4-14个氨基酸的接头肽；更佳的，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO. 6或9中所示的氨基酸序列。在本专利技术的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码本专利技术上述的融合蛋白。较佳地，所述的DNA分子编码包括SEQ ID NO. 6或9中所示的氨基酸序列的融合蛋白。更佳的，所述的DNA分子包括SEQ ID NO. 5或7、8中所示的核苷酸序列。在本专利技术第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体和含有上述载体的宿主细胞。在本专利技术第四方面，提供了一种产生本专利技术融合蛋白的方法，它包括步骤在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离纯化所述的融合蛋白。在本专利技术的第五方面，提供了一种药物组合物，它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的本专利技术的融合蛋白。在本专利技术的第六方面，提供了本专利技术融合蛋白的用途，它被用于制备治疗肿瘤的药物。附图说明图I显示了不同长度的Par4、氨基酸连接臂和Apo2L的不同拼接方式。其中表示Apo2L氨基酸序列；■ , , ■表示Par4氨基酸序列；......表示氨基酸连接臂序列； 表示缺失部分氨基酸。图2显示了一种特征性的Par4_Apo2L融合蛋白重组表达及纯化过程的电泳分析(SDS-PAGE)。其中A :诱导表达3小时后Par4_Apo2L的细菌破碎上清；B :未诱导表达Par4Apo2L的细菌破碎上清；C :诱导表达2小时后Par4_Apo2L的全菌；D :诱导表达I小时后Par4-Apo2L的全菌；E :金属亲和纯化的重组Par4_Apo2L融合蛋白质洗出液；F :硫酸铵盐析表达上清的活性组分；G :金属亲和纯化的重组Par4-Apo2L融合蛋白质活性峰；H S200进一步纯化的Par4-Apo2L ；1 :蛋白质分子量标记(kD)图3显示了一种特征性的SAC_Apo2L融合蛋白重组表达及纯化过程的电泳分析 (SDS-PAGE)。其中A :蛋白质分子量标记(kD) ；B :进一步纯化的SAC_Apo2L ；C :金属亲和纯化重组SAC-Apo2L融合蛋白质活性峰；D :金属亲和纯化时的洗出液；E :热诱导表达的SAC-Apo2L工程菌破碎上清；F 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白质，其特征在于它由下列元件组成：(a)人前列腺凋亡反应蛋白4(Par4)元件，该元件具有人Par4或其活性片段——选择性凋亡癌细胞区(SAC)的氨基酸序列，即具有SEQ？ID？NO.2中第1？340位、或145？203位的氨基酸序列；(b)人凋亡素2配体(Apo2L)元件，该元件具有人凋亡素2配体或其活性片段的氨基酸序列，即具有SEQ？ID？NO.4中第95？281、或114？281位的氨基酸序列；以及(c)位于人Par4元件和Apo2L元件之间的0？20个氨基酸的连接序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王梁华，张威，吴腾云，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：
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