本发明专利技术涉及人乳头瘤病毒型别杂合病毒样颗粒及其制备方法。所述病毒样颗粒可用于预防两种或两种以上HPV感染及由HPV感染所导致的疾病。本发明专利技术还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染及由HPV感染所导致的疾病如宫颈癌、尖锐湿疣等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地，本专利技术涉及由不同型别HPV LI蛋白杂合组装形成的，所述型别杂合病毒样颗粒可用于预防两种或两种以上HPV感染及由HPV感染所导致的疾病。本专利技术还涉及上述型别杂合病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染及由HP V感染所导致的疾病如宫颈癌、尖锐湿疣等。
技术介绍
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)主要引起皮肤,粘膜的抚状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为高危型与低危型，其中高危型的HPV感染被证实是诱发包括女性宫颈癌在内的肛生殖器癌症主要原因；低危型则主要引起尖锐湿疣。预防与控制HPV感染的最有效方式是HPV疫苗，特别是能引起宫颈癌的高危型HPV疫苗。HPV的主要衣壳蛋白LI具有自组装为空心病毒样颗粒(Virus-Like Particle,VLP)的特性。HPV VLP是由72个主要衣壳蛋白LI的五聚体以二硫键连接而构成20面体立体对称结构(Doorbar, J. and P. H. Gallimore. 1987. J Virol,61 (9) :2793-9)。HPV VLP结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表位，可诱导高滴度的中和抗体(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al. 1992Proc Natl Acad Sci U S A 89(24) :12180-4)。结构研究和突变分析表明，HPV16 LI蛋白Cysl75、Cysl85和Cys428对VLP的基本结构单位五聚体之间的相互作用起关键的作用，Cysl61、Cys229、Cys379对于单体分子间的相互作用是必需的，提示发生在LI蛋白分子内和/或分子间的二硫键对于HPV病毒样颗粒的组装有重要的作用(Ishii Y.，Tanaka K.，Kanda T. 2003 Virology. 308 :128-136)。本研究即对这些二硫键进行改造，专利技术新的人工HPV型别杂合病毒样颗粒。现有的研究发现，HPV VLP主要诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫，仅在一些同源性高的型别之间存在交叉保护。因此，现有的HPV疫苗的保护范围有限。如果要扩大HPV疫苗的保护范围只能通过增加疫苗中所含有的HPV VLP型别来实现。这将大大提高HPV疫苗的生产成本，并可能因为免疫剂量增加而带来潜在的安全性问题。而目前已上市的HPV疫苗(包括Merck公司的Gardas i I HPV16,18,6,11四价疫苗和GSK公司的Cervar ix HPV16，18 二价疫苗)均采用单独型别vlp混合制备而成的。因此，本领域仍然需要能够诱导针对多型别HPV保护性抗体的HPV LI病毒样颗粒，从而使制备预防更多型别HPV的宫颈癌疫苗成为可能。
技术实现思路
本专利技术至少部分基于专利技术人的以下的出人意料的发现利用大肠杆菌表达系统表达两个或两个以上不同型别的175位与428位半胱氨酸突变或缺失的HPV LI蛋白，所述突变或缺失的HPV LI蛋白单独不能形成病毒样颗粒，然而，按照一定的混合方式及一定的浓度比例混合后去除还原剂，可得到一种新的杂合VLP。该杂合VLP含有两种或两种以上的HPV LI蛋白，可诱导针对两种或两种以上HPV的高滴度中和抗体。因此，在一方面，本专利技术涉及组装成杂合病毒样颗粒的突变或缺失的HPV LI蛋白，所述蛋白包括但不限于HPV L1-C175A、HPV L1_AC428、HPV L1_AC175、HPV L1_C175S、HPVL1-C428A、HPV L1-C428S 等。在一个优选的实施方案中，HPV L1-C175A与HPV L1-AC428按照I : I的摩尔比混合。在其它实施方式中，二者的比例包括2 1、1 2等等。在另一个方面，本专利技术涉及一种制备本专利技术的杂合病毒样颗粒的方法。在一个优选实施方案中，制备本专利技术的杂合病毒样颗粒的方法包括a)在大肠杆菌中表达所述突变或缺失HPV LI蛋白，b)将表达所述突变或缺失HPV LI蛋白纯化，得到纯度95%以上的突变或缺失HPVLI蛋白， c)将b)纯化的突变或缺失LI蛋白HPV L1-C175A与HPV LI-AC428按照I : I的摩尔比混合，透析去除还原剂，即得到杂合VLP。d)将c)得到的杂合VLP进一步纯化，收集颗粒组分。本专利技术还涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本专利技术的HPV杂合VLP与药学可接受的载体和/或赋形剂混合，任选地还混合一种或多种选自HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58和59的HPV型别的病毒样颗粒或其他型别的杂合VLP。如上所论述的，所获得的疫苗可以用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病如宫颈癌等。在另一个方面，还涉及根据本专利技术的杂合病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。本专利技术中相关术语的说明及解释在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的定义和解释。根据本专利技术，术语“HPV LI”是指人乳头瘤病毒(HPV)的LI蛋白，其序列是本领域公知的(参见，例如NCBI数据库序列号DQ469930. I)。在本专利技术中，当涉及HPV LI的序列时，参考 Ishii Y，Tanaka K，Kanda T. Virology. (2003)，308 (I)，128-36。其使用 NCBI 数据库序列号DQ469930. I进行描述。根据本专利技术，术语“HPV LI突变体蛋白”是指，在LI蛋白中的某一位或某几位半胱氨酸(C)残基进行缺失或用其它氨基酸残基置换所获得的蛋白质，非必需地包括对LI蛋白进行N端或C端的缺失。根据本专利技术，术语“HPV X-C Y Z”是指，用Z氨基酸残基置换HPV X型LI蛋白质第Y位的半胱氨酸(C)残基所获得的蛋白质，其中X是指HPV的型别，Y是指GenBankABR)6542. 1(其核苷酸序列为DQ469930. I)氨基酸序列的从N端甲硫氨酸(M)开始计数的氨基酸所处的位置，如X = 16，Y = 175是指ABR)6542. I氨基酸序列的第175位氨基酸半胱氨酸C，非HPV16型别的Y值则指将目标蛋白序列与ABR)6542. I氨基酸序列进行序列比对(可使用Blast、FaSta、CluSter等程序)后，相应于ABR)6542. I氨基酸序列的位置。如“HPV16-C175A”指用丙氨酸(A)残基置换HPV16型LI蛋白质ABR)6542. I的第175位的半胱氨酸(C)残基所获得的蛋白质；“HPV52-C175A”指用丙氨酸(A)残基置换HPV52型LI蛋白质中对应于ABR)6542. I氨基酸序列的第175位残基的半胱氨酸残基(C)后所获得的蛋白质。根据本专利技术，术语“HPV X-AC Y”是指，将HPV X型LI蛋白质的第Y位的半胱氨酸(C)残基缺失所获得的蛋白质，其中氨基酸位置本文档来自技高网...
【技术保护点】
包含两个或更多个不同型别的HPV？L1蛋白的杂合病毒样颗粒，其中所述HPV？L1蛋白在第175位与428位半胱氨酸发生置换和/或缺失。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李少伟，魏旻希，王大宁，顾颖，张军，夏宁邵，
申请(专利权)人：厦门大学，厦门万泰沧海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。