本发明专利技术的目的在于提供使用启动子、增强子等来提高特别是外源基因的表达的方法；以及含有启动子、增强子等的可提高基因表达的表达用盒；本发明专利技术通过下述基因表达用盒达成上述目的：该表达用盒含有DNA构建体，并在该DNA构建体的下游含有增强子或第2启动子，所述DNA构建体在第1启动子下游含有所要表达的基因和polyA附加序列。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用启动子、增强子等来提高基因表达的方法；以及含有启动子、增强子等的提闻基因表达的表达用盒。
技术介绍
以往，为了提高基因表达效率，开发出了 CMV启动子、CAG启动子等各种基因表达启动子(专利文献I 4)。但是，在生物
中，即使使用这些现有技术，根据细胞种类或基因种类的不同，通常也会出现几乎不发生基因表达、或表达蛋白质量极少这样的问题。并且，该问题在将基因表达用于诊断或治疗的医疗的进步中成为较大的障碍。专利文献I :日本专利公报第2814433号公报专利文献2 :日本专利公报第2814434号公报专利文献3 :美国专利第5168062号说明书专利文献4 :美国专利第5385839号说明书
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种使用启动子、增强子等来提高基因表达的方法；以及一种含有启动子、增强子等的可提闻基因表达的表达用盒。在利用了启动子的基因表达系统中，本专利技术人尝试开发出一种可以以更高的效率进行基因表达的新系统，对各种基于基因的启动子、增强子的组合所得到的启动子活性进行了比较、研究。结果发现，通过使用基因表达用盒(其在DNA构建体的下游连接有增强子或第2启动子，所述DNA构建体在第I启动子的下游含有所要表达的基因和polyA附加序列)，将所要表达的基因夹在2个启动子之间、或夹在启动子与增强子之间，可使基因高效表达。本专利技术人进一步发现，通过使上述表达用盒中含有polyA附加序列、RU5’、UAS、SV40-ori等元件，能够进一步高效地进行基因的表达。通过本专利技术的“提高基因表达的系统和保持有该系统的载体”的开发，可针对大致全部的细胞、基因使蛋白质表达得到强力提闻。即，本专利技术如下。 一种基因表达用盒，该表达用盒含有DNA构建体，并在该DNA构建体的下游含有增强子或第2启动子，所述DNA构建体在第I启动子下游含有所要表达的基因和polyA附加序列。如所述的表达用盒，其中，在所连接的增强子或第2启动子的下游不具有其它基因表达用机构，具有所要表达的基因被夹在一个第I启动子与一个增强子之间、或者被夹在一个第I启动子与一个第2启动子之间的结构。如所述的表达用盒，其中，启动子为选自由CMV i启动子、SV40启动子、hTERT启动子、P肌动蛋白启动子和CAG启动子组成的组中的启动子。如 的任一项所述的表达用盒，其中，增强子为选自由CMV增强子、SV40增强子和hTERT增强子组成的组中的至少I种增强子。如 的任一项所述的表达用盒，其在DNA构建体的上游进一步连接有I 4个CMV增强子，所述DNA构建体在启动子的下游含有编码所要表达的蛋白质的DNA和polyA附加序列。如 的任一项所述的表达用盒,其进一步含有下述元件的至少任意之⑴连接在紧靠编码外源蛋白质的DNA的上游的RU5’ ；(ii)连接在紧靠增强子和/或启动子的上游的UAS ;和(iii)连接在表达用盒的最上游的SV40_ori。如 的任一项所述的表达用盒，其中，所要表达的基因为可用于疾病治疗的治疗用基因，或者为可用于药物、诊断试剂或试剂的蛋白质的基因。 如所述的表达用盒，其中，治疗用基因是可用于肿瘤的治疗的抑癌基因。如所述的表达用盒，其中，抑癌基因为REIC/Dkk-3基因。如所述的表达用盒，其中，所要表达的基因为REIC/Dkk-3基因的片段DNA。如所述的表达用盒，其中，REIC/Dkk-3基因的片段DNA为编码序列编号18的氨基酸序列的第I 78氨基酸的DNA。如所述的外源基因表达用盒，其具有构建体No. 2 (图8)、No. 4 (图10)、No. 6(图 12) ,No. 8 (图 14)、No. 10 (图 16)、No. 12 (图 18)和 No. 14 (图 20)所示的结构。如所述的外源基因表达用盒，其具有构建体No. 15 (图16)、No. 16 (图37) 'No. 17 (图 49) 'No. 20 (图 57)和 No. 21 (图 58)所示的结构。 一种载体，其含有 任一项所述的外源基因表达用盒。如所述的载体,其为腺病毒载体或腺相关病毒载体。 一种宿主细胞，其含有或所述的载体。 一种疾病检测或治疗用制剂，其含有或所述的载体。 一种使所要表达的基因进行表达的方法，其使用 的任一项所述的表达用盒、或者或所述的载体。 一种使所要表达的基因进行表达的方法，在该方法中，将在DNA构建体的下游连接有增强子或第2启动子而成的物质导入至载体中，并使用该载体进行上述基因的表达；所述DNA构建体在第I启动子的下游含有所要表达的基因和polyA附加序列。 一种所要表达的基因所编码的蛋白质的制造方法，其包括如下步骤将 的任一项所述的表达用盒、或者或所述的载体导入至细胞中，对该细胞进行培养。本说明书中包括作为本申请优先权基础的日本专利申请2009-264299号的说明书和/或附图中记载的内容。附图说明图I为示出了使用FuGENE (商标)-HD在HEK293细胞株中进行了 36小时转染的各种外源基因的表达的图。图2为示出了使用FuGENE (商标)-HD在各种细胞株中进行了 36小时转染的KLF基因的表达的图。图3为示出了使用各种转染试剂在HEK293细胞株中进行了 36小时转染的KLF基因的表达的图。图4为示出了使用FuGENE (商标)-HD使全长REIC基因和编码N78-REIC的基因在HEK293细胞株中进行了 36小时转染的情况下的表达的图。图5-1为示出了利用构建体No. 14 (其插入有编码N78-REIC的DNA)进行的人前列腺癌细胞PC3细胞株的增殖抑制与细胞死亡诱导的图(曲线图)。图5-2为示出了利用构建体No. 14 (其插入有编码N78-REIC的DNA)进行的人前列腺癌细胞PC3细胞株的增殖抑制与细胞死亡诱导的图(照片)。图6为示出了利用插入有全长REIC基因的构建体No. 14进行的人前列腺癌细胞PC3细胞株的增殖抑制的图。 图7为示出了构建体No. I的结构的图。图8为示出了构建体No. 2的结构的图。图9为示出了构建体No. 3的结构的图。图10为示出了构建体No. 4的结构的图。图11为示出了构建体No. 5的结构的图。图12为示出了构建体No. 6的结构的图。图13为示出了构建体No. 7的结构的图。图14为示出了构建体No. 8的结构的图。图15为示出了构建体No. 9的结构的图。图16为示出了构建体No. 10的结构的图。图17为示出了构建体No. 11的结构的图。图18为示出了构建体No. 12的结构的图。图19为示出了构建体No. 13的结构的图。图20为示出了构建体No. 14的结构的图。图21为示出了编码全长REIC/Dkk-3基因的腺病毒构建体的结构的图。图22-1为示出了 pDNR-lr供体载体的全碱基序列的图。图22-2为示出了 pDNR-lr供体载体的全碱基序列的图(续图22_1)。图23为示出了 pIDT-SMART载体的全碱基序列的图。图24为示出了 CMV i启动子(hCMV+内含子启动子)区域的碱基序列的图。图25为示出了 BGH polyA(3X stop+BGH polyA)区域的碱基序列的图。图26为示出了 CMV增强子区域的碱基序列的图。图27为不出了本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：公文裕巳，许南浩，阪口政清，渡部昌实，
申请(专利权)人：国立大学法人冈山大学，桃太郎源株式会社，
类型：发明
国别省市：
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