本发明专利技术公开了一种miR-202实时荧光定量PCR检测方法，包括）外周血中单个核细胞的分离、细胞中总RNA的提取、逆转录合成cDNA反应体系、荧光定量PCR扩增检测。本发明专利技术操作方便、检测准确；所采用的实时荧光定量PCR检测方法，巧妙地运用PCR技术的DNA高效扩增，高效、灵敏地检测miR-202。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种。
技术介绍
microRNA (miRNA)是一类由内源基因编码的长度为18 24个核苷酸的非编码单链RNA分子，普遍存在于各种生物中。miRNA在各种生理和病理过程中起重要的作用，并参与生命过程中一系列的重要进程，包括细胞增殖、分化和凋亡，个体发育，机体代谢及免疫调节。这些miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过抑制翻译或断裂靶mRNA而调节基因的表达。miRNA并不是在发育的特定时段表达，而是更倾向于在特定细胞类型中表达。miRNA的这种表达模式具有分化的位相性和时序性，提示miRNA有可能作为参与调控基因表达的分子。现有技术尚无完整的miR-202的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种准确、易操作的。本专利技术的技术解决方案是一种，其特征是包括下列步骤(I)外周血中单个核细胞的分离取新鲜血液3ml，用EDTA抗凝；取淋巴细胞分离液，加入到15ml锥形离心管中，淋巴细胞分离液与血液的重量比为1:2 ;再将血液沿管壁铺到淋巴细胞分离液上面，2000r/min下离心20min,取血楽；层与分层液交界处浑池的富含单个核细胞的灰白层,用生理盐水洗涤2次，1500r/min离心lOmin，最后弃去上清，得分离的外周血中单个核细胞，_80°C冰箱保存；(2 )细胞中总RNA的提取取分离的外周血中单个核细胞5X IO6个，加入Iml Trizol，混匀，室温静置5min ;加入0. 2ml氯仿，振荡15sec,室温静置2min ;4°C离心，12000r/min 15min,吸取上清至另一个I. 5ml离心管中；加入0. 5ml异丙醇，混匀，室温静置IOmin ;4°C离心，12000r/minI Omin,吸弃上清；加入1111175%乙醇，洗漆沉淀,4°C离心,7500r/min 5min,吸弃上清；晾干，加入20iil0. I %焦碳酸二乙酯(DEPC)H2O溶解，采用紫外分光光度计检测RNA溶液浓度及纯度，取A260/A280在I. 8 2. I用于实验；(3)逆转录合成cDNA反应体系用RNA template 2 u g, RT Primer2 u I, ddH20 补足至 11 U I,混勻离心,70°C放置lOmin，冰育 2min，再加入以下试剂RT buffer5X5u 1，dNTP mix2 u l,40U/u I 的 RNaseinhibitorO. 5u l,200U/u I 的 RT 酶 0. 1，ddH20 补足至 25 u 1，混匀，42°C 60min,70°CIOmin ;合成得到的cDNA放_80°C冰箱保存备用；(4)荧光定量PCR扩增检测反应体系MaximaTMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X ) 22. 5 ii 1，正反向5 ii M 的 Bulge-LoopTM miRNA Primer 各 5 y 1，RT-PCR 产物 2 y 1，RNase-free H2O 补足至50ii I ;95°C预变性 20sec，I 个循环；95°C 10sec,60°C 20sec,70°C 31sec，40 个循环；每管设立三个复孔；整个荧光定量PCR扩增反应过程冰上操作。步骤(4)后，还经下列步骤(5)荧光定量PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳。步骤(2)中加入0. 1% DEPC H2O溶解是在65°C下促溶10 15min。本专利技术操作方便、检测准确；所采用的实时荧光定量PCR检测方法，巧妙地运用PCR技术的DNA高效扩增，高效、灵敏地检测miR-202。 下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。具体实施例方式一种，包括下列步骤留取待检全血标本3ml，用Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞。miR-202 和 U6 小核 RNA (U6 snRNA)逆转录(RT)引物、Bulge-Loop miRNA 引物(广州锐博生物科技有限公司)，淋巴细胞分离液(加拿大Cedarlane公司)，Trizol (美国Invitrogen公司)，逆转录试剂、MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X ,立陶宛 Fermentas公司)，DNA分子标记(大连Takara生物工程公司)。(I)外周血中单个核细胞的分离无菌采取新鲜血液3ml，用EDTA抗凝。取淋巴细胞分离液(按与血液1:2的比例)，加入到15ml锥形离心管中，再将血液沿管壁轻轻铺到分离液上面,2000r/min离心20min,取血浆层与分层液交界处浑浊的灰白层(富含单个核细胞)，用生理盐水洗涤2次，1500r/min离心IOmin,最后弃去上清，_80°C冰箱保存。(2 )细胞中总RNA的提取取分离的外周血中单个核细胞5X IO6个，加入Iml Trizol，充分混匀，室温静置5min ;加入0. 2ml氯仿，充分振荡15sec,室温静置2min ;4°C离心，12000r/min 15min,吸取上清(约500 ii I)至另一个I. 5ml离心管中；加入0. 5ml异丙醇,轻轻混匀，室温静置IOmin ;4°C离心，12000r/min IOmin,吸弃上清；加入lml75%乙醇，轻轻洗漆沉淀，4°C离心，7500r/min 5min，吸弃上清;晾干，加入20iil0. I %焦碳酸二乙酯(DEPC)H2O溶解(65°C促溶10 15min)。采用紫外分光光度计检测RNA溶液浓度及纯度，取A260/A280在I. 8 2.I用于实验。(3 )逆转录合成cDNA反应体系RNA template2 U g, RT Primer2 U I, ddH20 补足至 11 U I,混勻离心，70 °C 放置IOmin,冰育 2min,再加入以下试剂RT buffer5X 5 u I, dNTP mix2 u I, RNase inhibitor(40U/u I) 0. 5 u 1，RT 酶(200U/ii I) 0. 5u 1，ddH20 补足至 25 y 1，混匀，42°C 60min,70°CIOmin。合成的cDNA放_80°C冰箱保存备用。(4)荧光定量PCR扩增反应反应体系MaximaTMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X ) 22. 5 ii 1，正反向Bulge-LoopTM miRNA Primer (511]\0各5111，RT-PCR 产物 2 y 1，RNase-free H2O 补足至50 u I0 95°C预变性 20sec，I 个循环；95°C 10sec,60°C 20sec,70°C 31sec，40 个循环。每管设立三个复孔。注整个过程冰上操作。(5 )荧光定量PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳因miR-202和U6分子量小，所以PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，且随时注意观察，防止分子跑出胶外。(6)对上述建立荧光定量PCR检测miR-202的方法进行特异性、重复性等方法学评价。结果计算反应设立3个复孔，记录每个反应管中的荧光信号到达阈值时所经历的PCR循环次数(Ct值)。取一样本，连续3天内分别对miR-202和U6 snRNA进行批内和批间的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种miR？202实时荧光定量PCR检测方法，其特征是：包括下列步骤：（1）外周血中单个核细胞的分离：取新鲜血液3ml，用EDTA抗凝；取淋巴细胞分离液，加入到15ml锥形离心管中，淋巴细胞分离液与血液的重量比为1:2；再将血液沿管壁铺到淋巴细胞分离液上面，2000r/min下离心20min，取血浆层与分层液交界处浑浊的富含单个核细胞的灰白层，用生理盐水洗涤2次，1500r/min离心10min，最后弃去上清，得分离的外周血中单个核细胞，？80℃冰箱保存；（2）细胞中总RNA的提取取分离的外周血中单个核细胞5×106个，加入1ml？Trizol，混匀，室温静置5min；加入0.2ml氯仿，振荡15sec，室温静置2min；4℃离心，12000r/min？15min，吸取上清至另一个1.5ml离心管中；加入0.5ml异丙醇，混匀，室温静置10min；4℃离心，12000r/min？10min，吸弃上清；加入1ml？75％乙醇，洗涤沉淀，4℃离心，7500r/min？5min，吸弃上清；晾干，加入20μl0.1％焦碳酸二乙酯H2O溶解，采用紫外分光光度计检测RNA溶液浓度及纯度，取A260/A280在1.8～2.1用于实验；（3）逆转录合成cDNA反应体系：用RNA？template？2μg，RT？Primer？2μl，ddH2O补足至11μl，混匀离心，70℃放置10min，冰育2min，再加入以下试剂：RT？buffer5× 5μl，dNTP？mix？2μl，40U/μl的RNase？inhibitor0.5μl，200U/μl的RT酶0.5μl，ddH2O补足至25μl，混匀，42℃？60min，70℃？10min；合成得到的cDNA放？80℃冰箱保存备用；（4）荧光定量PCR扩增检测：反应体系：MaximaTM？SYBR？Green/ROX？qPCR？Master？Mix（2×）22.5μl，正反向5μM的Bulge？LoopTM？miRNA？Primer各5μl，RT？PCR产物2μl，RNase？free？H2O补足至50μl；95℃预变性20sec，1个循环；95℃？10sec，60℃？20sec，70℃？31sec，40个循环；每管设立三个复孔；整个荧光定量PCR扩增反应过程冰上操作。...
【技术特征摘要】
1.一种miR-202实时荧光定量PCR检测方法，其特征是包括下列步骤 (1)外周血中单个核细胞的分离 取新鲜血液3ml，用EDTA抗凝；取淋巴细胞分离液，加入到15ml锥形离心管中，淋巴细胞分离液与血液的重量比为1:2 ;再将血液沿管壁铺到淋巴细胞分离液上面，2000r/min下离心20min，取血浆层与分层液交界处浑浊的富含单个核细胞的灰白层，用生理盐水洗涤2次，1500r/min离心lOmin，最后弃去上清，得分离的外周血中单个核细胞，_80°C冰箱保存； (2)细胞中总RNA的提取 取分离的外周血中单个核细胞5X IO6个,加入Iml Trizol,混勻，室温静置5min ;力口AO. 2ml氯仿,振荡15sec,室温静置2min ;4°C离心，12000r/min 15min,吸取上清至另一个I. 5ml离心管中；加入0. 5ml异丙醇，混勻，室温静置IOmin ;4°C离心，12000r/min IOmin, 吸弃上清；加入Iml 75%乙醇,洗漆沉淀，4°C离心，7500r/min 5min,吸弃上清；晾干,力口A 20 u 10. I %焦碳酸二乙酯H2O溶解，采用紫外分光光度计检测RNA溶液浓度及纯度，取A260/A280在I. 8 2. I用于实验； (3)逆转录合成cDNA反应体系 用 RNA template 2 u g, RT Primer 2 u I...
【专利技术属性】
技术研发人员：鞠少卿，申娴娟，王旭东，张霞，施维，戚菁，吴信华，郭益冰，李晓红，陆晶晶，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：
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