本发明专利技术公开了一种甘油磷脂酰乙醇胺(L-alpha?glycerylphosphorylethanolamine，L-α-GPE)的制备方法，属于脂质开发应用技术领域。包括如下步骤：以大豆粉末磷脂为原料，在水相中，用脂肪酶水解磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)生产L-α-GPE；阳离子和阴离子交换树脂柱色谱分别去除阳离子和阴离子，硅胶柱色谱纯化，活性炭脱色，真空浓缩，得到无色透明的L-α-GPE。HPLC-ELSD分析，化学纯度99.6％，回收率66.5％；旋光仪分析，光学纯度ee：99％，(H2O含量15.7％)。
【技术实现步骤摘要】
一种甘油憐脂酸乙醇胺(L-alpha glycerylphosphorylethanolamine, L- a -GPE)的制备方法，涉及到食品化学、精细化学、有机化学和药物化学领域。
技术介绍
甘油憐脂酸乙醇胺(L-alphaglycerylphosphorylethanolamine, L- a -GPE)为体内天然存在的水溶性磷脂代谢产物，它的原子结构示意图I所示。它主要存在于猪和兔的肝脏、以及牛的大脑当中，是生物体内脑磷脂、卵磷脂和磷脂酰丝氨酸等磷脂成分生物合成的前体。L- a -GPE具有重要的医药应用价值，它能治疗人体的各种神经和心理功能缺陷方面的疾病，如心理活动缓慢、记忆力随着年纪增长下降，以及情绪不稳和心里感情比较脆弱等方面的疾病。 目前，在国内和国际上制备L-a-GPE的方法，主要包括生物组织器官溶剂萃取(G.B. Ansell et al, J. Neurochem. 1956,1, 32)、烯醒憐脂的催化水解(R. Pietruszko andG. M. Gray, Biophys. Acta. 1962，56，232)、化学合成(US4918062)、蛋黄磷脂和大豆磷脂醇解(EP 0 217 765)等生产方法，以及溶剂萃取(G.B. Ansell et al, J. Neurochem. 1956，1，32)、沉淀法(EP :0 217 765)、薄层色谱(G.B. Ansell et al, J. Neurochem. 1953,55,768)和树脂柱色谱(J. N. Hawthorne et al, Biochem. J. 1959, 71,195)等纯化方法。这些方法在产品的纯度、旋光度纯度、回收率和环境污染等方面都存在不同程度的问题。如生物组织器官溶剂萃取方法受限于原材料的供应，因此很难实现大规模的工业化生产；烯醛磷脂的催化水解和沉淀法都存在重金属离子残留，同时在环境污染方面存在一定的问题；蛋黄磷脂和大豆粉末磷脂的醇解制备L-a -GPE，不仅在得率方面、纯度方面，在环境污染方面同样面临着挑战；薄层色谱和树脂柱色谱方法能实现了很好的分离，但是在制备的产量、产品的得率、以及产品的旋光度方面遇到了一定的瓶颈。脂肪酶水解法生产L-a-GPE非常有吸引力，主要是因为酶法催化具备催化效率高、反应时间短、生产成本低等方面的优势；同时树脂和硅胶柱色谱结合法纯化L- a -GPE,具有分离效率高、成本低等优点。因此，我们建立了脂肪酶生产和硅胶柱色谱纯化制备L- a -GPE的方法，并且为其他天然产物的制备和纯化提供了一种新的思路和方法。本专利技术提供一种L- a -GPE的制备方法，解决了生产L_ a -GPE过程中面临的转化率低、旋光纯度低、环境污染等方面的问题，同时也解决了分离纯化方面的分离效率低、回收率低以及操作复杂等方面的问题。通过对酶解反应条件和硅胶柱色谱纯化条件的优化研究，最终产品纯度达到99.8%，回收率66. 5%，比旋光度为-3. 26°。本专利技术的反应条件温和，纯化过程简单，是一种方便、经济、环保、可实现商业化规模制备L-a -GPE的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种脂肪酶水解大豆粉末磷脂生产和硅胶柱色谱纯化制备L-a-GPE的方法，该方法利用脂肪酶对大豆粉末磷脂进行水解，粉末磷脂中的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)上的两个脂肪酸酰基被水解后生成L-a -GPE,然后用阳离子和阴离子树脂柱色谱分别对阳离子和阴离子进行去除，再用硅胶色谱柱对L- a -GPE进行纯化，去除L- a -GPC和杂质,最后用活性炭对L- a -GPE水溶液进行脱色,去除色素和部分杂质，真空浓缩，得到无色的L-a -GPE。技术方案以粉末磷脂为原料，脂肪酶在水相体系中水解大豆粉末磷脂得到L- a -GPE，树脂和硅胶柱色谱进行纯化，活性炭进行脱色，真空浓缩，得到L- a -GPE0主要步骤包括(I)酶解反应将粉末磷脂加到蒸馏水中，形成磷脂水溶液的乳化体系，添加金属盐，混匀后加入脂肪酶，在温和条件下反应，反应结束后，真空抽滤，得到澄清酶反应液。(2)树脂吸附酶反应液，用阳离子树脂去除Ca2+，阴离子树脂去除Cl—。 (3)硅胶纯化工业硅胶活化，称量硅胶、装柱，反应液上柱，醇溶液洗脱，自动收集器收集，HPLC-ELSD进行监控，最后得到纯度比较高的L-a -GPE。(4)脱色用活性炭去除L-a -GPE溶液中的色素物质和少量杂质，使最终产品保持无色、透明状态。本方法中脂肪酶水解法生产L- a -GPE的步骤，大豆粉末磷脂中加入去离子水，固液比I : I I : 30g/mL，0 75°C水浴，均质后加入金属盐、脂肪酶，反应0 36h，得到L- a -GPE溶液，抽滤，得到清夜。本方法中硅胶纯化的步骤，硅胶称量、搅拌匀浆、装柱、上样、过柱、收集、检测。硅胶称量，干硅胶的密度大约0. 4g/mL ;上样，以硅胶重量计，I 50 (g/g，L- a -GPE :硅胶)；收集馏分的体积，以上样量计，I 10(g/mL,L-a-GPE :馏分体积)；用HPLC-ELSD检测，检测L-a -GPE和杂质，将同一类馏分合并。本专利技术利用脂肪酶水解大豆粉末磷脂生产和硅胶柱色谱法纯化制备L- a -GPE的方法，属于开创性的研究。附图说明图IL-a -GPE的结构示意图其中、表示H，攀表示C， 表示P，參表示0，馨表示No图2HPLC-ELSD 色谱图其中图2a表示酶反应初始原料的液相色谱图，图2b表示酶水解反应360min的液相色谱图，图2c表示树脂和硅胶柱色谱纯化后的液相色谱图从图2c可以看到只有L-a -GPE成分的峰，其纯度99. 8%。图3硅胶柱色谱的洗脱曲线从图3可以看出硅胶柱色谱法能很好的将L- a -GPE和杂质分离开。图4L- a -GPE 的 LC-TOF-MS 质谱图。从图3中可以看出，[M]和[2M_l]at m/z 216和431，主要碎裂峰为216，198，195，173，149，124，118，99，89，62，这些碎片与L- a -GPE标样碎裂的离子碎片是一致的。具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。应该理解的是，本专利技术实施例所述的制备方法仅仅是用于说明本专利技术，而不是对本专利技术的限制，在本专利技术的构思前提下对本专利技术制备方法的简单改进都属于本专利技术要求保护的范围。实施例I所用的原料为食品大豆粉末磷脂(其中PC含量约为24% )。脂肪酶水解反应50g粉末磷脂，IOOOmL去离子水，加入三孔烧瓶中，在35°C水浴加热，300r/min机械搅拌,均质30min,添加CaCl22g,均质,添加华根霉脂肪酶5mL,反应360min,将酶反应液离心、抽滤,得到纯净的酶解反应液。实施例2所用的酶解反应液为实施例I所得的产物。 树脂柱色谱去除酶反应液中的离子酶解反应液过001X7强阳离子交换树脂柱(交换容量1800mmol/L)去除Ca2+，过D311大孔型丙烯酸系弱碱阴离子交换树脂柱(2200mmol/L)去除Cl_，60°C，真空浓缩，离子交换树脂再生。实施例3所用的酶解反应液为实施例2去除离子后所得的产物。硅胶柱色谱纯化L- a -本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甘油磷脂酰乙醇胺(L？α？GPE)的制备方法，其特征在于，包括如下工艺步骤：(1)脂肪酶水解大豆粉末磷脂制备L？α？GPE：磷脂中加入去离子水，固液比1∶1～1∶30g/mL，0～75℃水浴，均质后加入金属盐、脂肪酶，反应0～36h，得到L？α？GPE溶液，抽滤，得到清夜。(2)树脂柱色谱去除阳离子和阴离子：阳离子交换树脂去除Ca2+，阴离子交换树脂去除Cl？，流速0.5～4mL/min，柱下收集液中不能检测到离子，吸附饱和后再生，再生次数1～10次，45～75℃旋蒸，然后溶于醇。(3)硅胶柱色谱法纯化L？α？GPE：称量硅胶，溶于醇，搅拌匀浆、过夜、装柱、压实、上样，0％～100％醇水溶液(v∶v，醇∶水)进行洗脱，流速0.5～4mL/min，每10～60mL馏分进行收集，HPLC？ELSD检测，合并L？α？GPE，硅胶再生。再生条件：烘箱中，100～150℃，时间2～8h，再生次数1～10。(4)L？α？GPE脱色：50～90℃，活性炭脱色，微孔滤膜抽滤，得到澄清的L？α？GPE溶液，45～75℃，减压浓缩，得到产品，醇进行回收。
【技术特征摘要】
1.一种甘油磷脂酰乙醇胺(L-a-GPE)的制备方法，其特征在于，包括如下工艺步骤 (1)脂肪酶水解大豆粉末磷脂制备L-a-GPE :磷脂中加入去离子水，固液比I : I I 3(^/1^，0 751水浴，均质后加入金属盐、脂肪酶，反应0 3611，得到1-[1-6 ￡溶液，抽滤，得到清夜。(2)树脂柱色谱去除阳离子和阴离子阳离子交换树脂去除Ca2+，阴离子交换树脂去除Cl_,流速0. 5 4mL/min,柱下收集液中不能检测到离子,吸附饱和后再生，再生次数I 10次，45 75°C旋蒸，然后溶于醇。(3)硅胶柱色谱法纯化L-a-GPE:称量硅胶，溶于醇，搅拌匀浆、过夜、装柱、压实、上样,0% 100%醇水溶液(V : V,醇水)进行洗脱,流速0. 5 4mL/min,每10 60mL懼分进行收集，HPLC-ELSD检测，合并L-a -GPE，硅胶再生。再生条件烘箱中，100 150°C，时间2 8h，再生次数I 10。(4)L- a -GPE脱色50 90°C，活性炭脱色，微孔滤膜抽滤，得到澄清的L- a -GPE溶液，4...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘元法，张康逸，周丽，孟宗，王兴国，宋志华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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