本发明专利技术提供一种优化(optimize)海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列，其是透过置换密码子使该序列能于原核生物及真核生物中表达，并且能产生免疫原性与海水白点虫纤毛幼虫纯化出的制动抗原相近的蛋白质。本发明专利技术该进一步提供一以该cDNA制造的DNA疫苗预防鱼类受海水白点虫感染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供一优化的海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸(cDNA)，及包含其之载体、以其生产的疫苗及其制造方法及用途。
技术介绍
周纤毛虫类原生动物寄生虫海水白点虫(Cryptocaryon irritans)是造成多种海水鱼类感染海水白点病的致病生物，野生鱼类、观赏鱼类或养殖鱼类都有可能遭受感染。目 前海水白点虫已是鱼类养殖场常见的寄生虫，其被认为是造成最严重渔业经济损害的寄生虫的一，不只亚洲养殖渔业(包括中国、台湾、日本、韩国、印度及其他亚洲国家)受到海水白点虫的威胁，澳洲、波斯湾、以色列红海、加勒比海等地亦有海水白点虫的踪迹，造成海水养殖渔业巨大的经济损失。虽然可使用化学药剂预防或治疗受海水白点虫感染的鱼类，但其会造成严重的海洋污染，且对人类健康有危害。海水白点虫的生命周期以四个阶段组成营养体(toophont)期、原分裂前体(protomont)期、分裂囊胞体(tomonts cyst)期及纤毛幼虫(theront)期，早期有关与海水白点虫分属动物分类学上不同门(phylum)的淡水白点虫(Ichthyophthiriusmultifiliis)的研究显示体液免疫可藉由制动(immobilize)纤毛幼虫达到预防感染的效果。有许多研究指出鱼类血液免疫及皮肤黏膜免疫在对抗海水白点虫上扮演重要角色，对海水白点虫的细胞免疫可由自然受感染鱼体的感染部位上的白血球渗入(Infiltration)及海水白点虫营养体上⑶8+白血球定位(localization)窥知，而对海水白点虫的非专一细胞免疫反应如外围血的嗜酸性白血球(eosinophil)数量降低及表皮层的黏膜细胞增生也在石斑鱼中被发现。许多研究指出对于海水白点虫营养体、原分裂前体及纤毛幼虫的免疫作用可在受感染鱼体中诱发更强的保护免疫力(protective immunity),其中纤毛幼虫期可提供较强的保护免疫力。由于海水白点虫是一绝对寄生虫，作为疫苗的纤毛幼虫仅能从受感染鱼体中得到，因此要搜集到足够量的活体纤毛幼虫用于生产疫苗相当费时费力且不切实际，且截至目前为止，并无技术可以利用离体方式使海水白点虫完成完整的生命周期。制动现象(immobilization phenomenon)是在离体实验中，由经免疫过后的鱼体的血浆及黏膜制动活体纤毛幼虫，此现象可于鱼体内发生并提供鱼体保护，其是抗体结合寄生虫细胞及纤毛表面抗原造成该寄生虫无法移动。制动现象的目标抗原称为致动抗原(immbolization antigens, iAg),其特征在于锚定大量糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl inositol,GPI)的表面膜蛋白。文献中指出，从淡水白点虫中分离出的制动抗原在诱发保护免疫力上扮演重要角色，该致动抗原的重组基因片段已被揭露可于金鱼体内产生对抗淡水白点虫的免疫反应，并有效提供保护免疫力。此外，有研究者曾利用受感染鱼体及产生免疫反应的兔子的抗血清和海水白点虫的营养体及纤毛幼虫，萃取出箝入性膜蛋白(integral membrane protein)与大量的表面抗原，并从血清型(serotype)G37的海水白点虫纯化及选殖出此发生表面凝集/制动现象的抗原。然而因细菌及真核生物无法使用该寄生虫的密码子，使该制动抗原DNA序列在大肠杆菌及真核细胞中难以表达，再者，经优化的制动抗原(CISA-32)亚克隆至PHSG299构筑的密码子仅能在细菌中表达，无法于哺乳类动物细胞、昆虫细胞或酵母菌细胞中表达。于本专利技术中，该制动抗原的密码子经修饰过后可顺利于大肠杆菌及鱼类细胞中表达该制动抗原重组蛋白，并且其具有免疫原性(immunogenic)。而本专利技术经由免疫测试证实该密码子经修饰后的制动蛋白可做为预防点带石斑鱼(E. coioides)或其他海水鱼类遭海水白点虫感染的疫苗。脱氧核糖核酸(DNA)疫苗是指注射经基因工程改造的DNA进入生物体引发免疫反应以达到预防感染疾病的效果的技术，核酸疫苗可应用于预防细菌、病毒及寄生虫感染，甚至可用来治疗肿瘤，但目前大部分仍处于实验阶段。相较于传统疫苗，DNA疫苗有许多优点，例如可同时诱发多种免疫反应。以人类而言，疫苗对现代医学有相当大的贡献，例如使天花、小儿麻痹、伤寒(typhus)、轮状病毒(TOtavirus)、A型肝炎、B型肝炎等疾病都藉由疫苗达到良好的控制。 然而，传统疫苗仅能对抗有限数量的疾病，目前仍有许多疾病缺乏有效疫苗防治，例如人类后天免疫不全症候群(AIDS)、C型肝炎、疟疾(malaria)等病症，仍待开发有效疫苗。对动物而言，疫苗及其预防接种是控制动物病原疾病、保障养殖业持续发展的重要手段。鱼类疫苗可分为灭活疫苗、减毒活疫苗、重组活疫苗、次单位疫苗以及DNA疫苗五大类；十年前已有一些细菌疫苗商品化，但病毒疫苗还很少，而寄生虫疫苗完全没有。因为鱼类疫苗存在免疫原力、生产成本和安全性等问题，大部分疫苗停留在实验室使用阶段，还未商品化生产。在开发疫苗过程中，所谓第一代疫苗是指全生物体疫苗(who I e-organ ismvaccine),其可能是活体、经弱化过的活体或死亡状态的生物,灭活疫苗或减毒活疫苗,例如天花及小儿麻痹疫苗，其可诱发细胞毒杀T淋巴球(T。或CTL)、辅助T细胞(Th)活化及抗体产生，但其存在毒性回复(reversion to virulence)的风险，灭活疫苗(killedvaccine)虽不具有此风险，但其无法诱发细胞毒杀T淋巴球活化，且生产上有其对应疾病的限制。为最小化上述风险，第二代疫苗应运而生，例如次单元疫苗(subunit vaccine),其是以已知蛋白质抗原(defined protein antigen)或重组蛋白组成，前者如破伤风(tetanus)疫苗及白喉(diphtheria toxoid)疫苗,后者如B型肝炎疫苗。第二代疫苗可诱发辅助T细胞及抗体产生，但仍然无法诱发细胞毒杀T淋巴球活化。DNA疫苗即第三代疫苗，其是以质粒透过基因工程技术处理，使其可产生一至两个属于病原体的特定抗原或蛋白质，当该DNA被送进体内细胞后，透过该质粒宿主细胞本身机制即可读取该DNA并转译出病原体的特定蛋白质,该蛋白质会被认定为外来蛋白质,便会被宿主细胞呈现至其表面，诱发免疫系统辨认并产生多种免疫反应。1993年以来，DNA疫苗以其高免疫保护率受到了广泛关注。DNA疫苗是指直接把带有目标抗原基因的重组质粒转染或注射到动物体内，使的表达出天然抗原物质。与传统疫苗相比，DNA疫苗的制作相对简单，成本低廉，运输保存容易，不存在毒力回复的现象。与灭活疫苗和次单位疫苗相比，DNA疫苗的效果更好。1996年，Anderson等首次将鱼传染性造血器官坏死症病毒(IPNV)的糖蛋白基因插入真核表达质粒以制成DNA疫苗，并免疫虹鳟鱼，发现能够诱导其产生强烈的保护性免疫反应，抵抗IPNV病毒的攻击。迄今为止，学者仍陆续进行鱼类DNA疫苗相关研究，并有突破性的发展。本专利技术即提供一种以海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸(cDNA)生产的疫苗及其制造方法及用途，该疫苗即为鱼类抗寄生虫的DNA疫苗，其可用于预防鱼类感染海水白点虫，是于该领域极具新颖性及进步性的专利技术。
技术实现思路
本专利技术提供一种优本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种优化海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸序列的方法，其包含：a.取得海水白点虫制动抗原的mRNA序列；b.将该mRNA序列转换为cDNA序列；c.根据该cDNA序列中终止码周围的密码子对应的氨基酸残基的特定特征推测出终止码特定氨基酸，使该终止码以能转译出该特定氨基酸的密码子取代后，转译出的蛋白与从该海水白点虫纤毛幼虫纯化出的制动抗原彼此的免疫原性相近；及d.将该终止码以能转译出该特定氨基酸的密码子取代，产生优化的cDNA序列；其中该特定特征是选自终止码周围密码子所对应的氨基酸残基的结构特性、疏水性、电荷分布所组成的群组。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋延龄，林彦宏，卜莉亚，
申请(专利权)人：宋延龄，
类型：发明
国别省市：
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