通过抑制SIRTUIN(SIRT)的天然反义转录物来治疗SIRTUIN(SIRT)相关性疾病制造技术

本发明专利技术涉及调节Sirtuin(SIRT)的表达和/或功能，特别是通过靶向Sirtuin(SIRT)的天然反义多核苷酸进行调节的反义寡核苷酸。本发明专利技术还涉及所述反义寡核苷酸的鉴别和其在治疗与Sirtuin(SIRT)的表达有关的疾病和病症中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请要求2009年7月24日提交的美国临时专利申请No. 61/228，392、2009年11月6日提交的美国临时专利申请No. 61/259，072、2009年12月2日提交的PCT专利申请No. PCT/US09/66445、2010 年 3 月 3 日提交的 PCT 专利申请 No. PCT/US10/26119 和 2010 年5月3日提交的美国临时专利申请No. 61/330，427的优先权。本专利技术的实施方案包括调节Sirtuin (SIRT)的表达和/或功能的寡核苷酸和相关分子。
技术介绍
DNA-RNA和RNA-RNA杂交对于多个方面的核酸功能(包括DNA复制、转录和翻译)是重要的。杂交还是检测特定核酸或改变其表达的多种技术的关键。反义核苷酸例如通过与靶RNA杂交，由此干扰RNA拼接、转录、翻译和复制来扰乱基因表达。反义DNA还具有DNA-RNA杂交体充当核糖核酸酶H(—种存在于大部分细胞类型中的活性)消化的底物的附加特征。反义分子可递送到细胞中，如同在寡脱氧核苷酸(ODN)的情况下，或者其可由内源性基因表达为RNA分子。FDA最近批准了一种反义药物VITRAVENE (用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎)，反映反义分子具有治疗效用。
技术实现思路
在一个实施方案中，本专利技术提供通过使用靶向天然反义转录物的任何区的反义寡核苷酸来抑制天然反义转录物的作用，从而使相应有义基因得到上调的方法。本文中还预期，抑制天然反义转录物可利用siRNA、核酶和小分子达成，这些分子视为在本专利技术的范围内。一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与包含以下序列内5至30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补序列具有至少50%序列同一性SEQ ID NO 5的核苷酸I至1028或SEQ IDNO 6的核苷酸I至429或SEQ ID NO 7的核苷酸I至156或SEQ ID NO 8的核苷酸I至593、SEQ ID NO :9 的 I 至 373、SEQ ID NO : 10 的 I 至 1713、SEQ ID NO : 11 的 I 至 660、SEQID NO : 12 的 I 至 589、SEQ ID NO : 13 的 I 至 428 和 SEQ ID NO : 14 的 I 至 4041，由此在体内或体外调节患者细胞或组织中Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达。在另一实施方案中，寡核苷酸靶向Sirtuin(SIRT)多核苷酸(例如SEQ ID NO 5至14中所述的核苷酸)的天然反义序列和其任何变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO : 15至94所述。另一实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与所述Sirtuin(SIRT)多核苷酸的反义分子的反向互补序列具有至少50%序列同一'丨生；由此在体内或体外调节所述Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达。另一实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与Sirtuin(SIRT)反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50%序列同一'丨生；由此在体内或体外调节所述Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达。 在一个实施方案中，组合物包含一种或多种结合有义和/或反义Sirtuin(SIRT)多核苷酸的反义寡核苷酸。在另一实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个经过修饰或取代的核苷酸。在另一实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个经过修饰的键。在另一实施方案中，经过修饰的核苷酸包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’ -0-甲基、氟-或碳、亚甲基或其它锁核酸(locked nucleic acid ；LNA)分子的修饰碱基。经过修饰的核苷酸优选为锁核酸分子，包括a-L-LNA。在另一实施方案中，寡核苷酸是皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内施用于患者。在另一实施方案中，寡核苷酸是以药物组合物形式施用。治疗方案包括向患者施用至少一次反义化合物；然而，此治疗可修改为包括一段时间内的多次剂量。所述治疗可与一种或多种其它类型的疗法组合。在另一实施方案中，寡核苷酸囊封于脂质体中或连接于载体分子(例如胆固醇、TAT 肽)。其它方面在下文进行描述。附图说明图I和图2示出针对SIRT反义分子CV396200设计的寡核苷酸的实时PCR结果。所述结果表明HepG2细胞中SIRTlmRNA的水平在用一种针对sirtas设计的siRNA (sirtas_5,P = 0. 01)处理48小时后显著增加。在相同样品中，sirtas RNA的水平在用sirtas_5处理后显著降低，但在用sirtas_6和sirtas_7处理后未改变，sirtas_6和sirtas_7对SIRTlmRNA 水平也没有影响(图 2)。sirtas_5、sirtas_6 和 sirtas_7 分别对应于 SEQ IDNO 38,39 和 40。图3示出SIRT反义分子上寡核苷酸行走的结果。实时PCR结果表明HepG2细胞中SIRTlmRNA的水平在用三种针对sirtas设计的反义寡核苷酸处理48小时后显著增加。CUR-0292 至 CUR-0309 分别对应于 SEQ ID NO : 15 至 32。图4和图5示出在H印G2(图4)和Vero76 (图5)细胞中经过PS、LNA和2，0 Me修饰的寡核苷酸的结果。实时PCR结果表明HepG2细胞中SIRTlmRNA的水平在用针对SIRTl反义分子的经过PS、LNA、2’ 0 Me和2’ 0 Me混合寡聚物设计的反义寡核苷酸处理48小时后显著增加。Vero细胞中SIRTlmRNA的水平在用经过PS和LNA修饰的SIRTl反义分子的反义寡核苷酸处理48小时后也增加。表示为CUR-0245、CUR-0736、CUR 0688、CUR-0740和CUR-0664的柱条分别对应于SEQ ID NO 33至37。图6示出猴脂肪组织活检的PCR结果。实时PCR结果表明来自给予⑶R-963 ( 一种针对SIRTl反义分子CV396200. I设计的寡核苷酸)的猴的脂肪组织活检中的SIRTlmRNA水平增加。CUR-963对应于SEQ ID NO :34。图7示出原代猴肝细胞的PCR结果。实时PCR结果表明SIRTlmRNA水平在用针对SIRTl反义分子的寡核苷酸处理后增加。表示为CUR-0245的柱条对应于SEQ ID NO :33。图8示出针对SIRT反义分子CV396200设计的寡核苷酸的结果。实时PCR结果表明HepG2细胞中SIRTlmRNA的水平在一种针对SIRTl反义分子CV396200设计的寡核苷酸中显著增加。表示为 CUR-1230、CUR-1231、CUR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.07.24 US 61/228,392;2009.11.06 US 61/259,072;1.ー种在体内或体外调节患者细胞或组织中的Sirtuin (SIRT)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少ー种长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与包含以下序列内的5至30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补序列具有至少50%序列同一性SEQ ID NO 5的核苷酸I至1028或SEQID NO 6的核苷酸I至429或SEQ ID NO 7的核苷酸I至156或SEQ ID NO 8的核苷酸I至 593、SEQ ID NO :9 的 I 至 373、SEQ ID NO : 10 的 I 至 1713、SEQ ID NO : 11 的 I 至 660、SEQ ID NO 12 的 I 至 589、SEQ ID NO 13 的 I 至 428 和 SEQ ID NO 14 的 I 至 4041 ;由此在体内或体外调节患者细胞或组织中的所述Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达。2.—种在体内或体外调节患者细胞或组织中的Sirtuin (SIRT)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少ー种长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与Sirtuin(SIRT)多核苷酸的天然反义分子的反向互补序列具有至少50%序列同一性；由此在体内或体外调节患者细胞或组织中的所述Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达。3.—种在体内或体外调节患者细胞或组织中的Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少ー种长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与所述Sirtuin(SIRT)多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50%序列同一'注；由此在体内或体外调节患者细胞或组织中的所述Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达。4.ー种在体内或体外调节患者细胞或组织中的Sirtuin (SIRT)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少ー种靶向所述Sirtuin(SIRT)多核苷酸的天然反义寡核苷酸的区的反义寡核苷酸接触；由此在体内或体外调节患者细胞或组织中的所述Sirtuin(SIRT)多核苷酸的功能和/或表达。5.根据权利要求4所述的方法,其中体内或体外所述Sirtuin(SIRT)的功能和/或表达相对于对照增强。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向Sirtuin(SIRT)多核苷酸的天然反义序列。7.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向包含Sirtuin(SIRT)多核苷酸的编码和/或非编码核酸序列的核酸序列。8.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向Sirtuin(SIRT)多核苷酸的重叠和/或不重叠序列。9.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸包含一个或多个选自以下的修饰至少ー个经过修饰的糖部分、至少ー个经过修饰的核苷间键联、至少一个经过修饰的核苷酸和其组合。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述ー个或多个修饰包括至少ー个选自以下的经过修饰的糖部分经过2' -O-甲氧基こ基修饰的糖部分、经过2'-甲氧基修饰的糖部分、经过2' -O-烷基修饰的糖部分、双环糖部分和其组合。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述ー个或多个修饰包括至少ー个选自以下的经过修饰的核苷间键联硫代磷酸酷、2' -O甲氧基こ基(MOE)、2'-氟、烷基膦酸酯、ニ硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酷、氨基磷酸酷、氨基甲酸酷、碳酸酯、磷酸三酷、氨基こ酸酷、羧甲基酷和其组合。12.根据权利要求9所述的方法，其中所述ー个或多个修饰包括至少ー个选自以下的经过修饰的核苷酸肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、阿拉伯糖核酸(FANA)、其类似物、衍生物和组合。13.根据权利要求I所述的方法，其中所述至少ー种寡核苷酸包含至少ー种如SEQIDNO : 15至94所述的寡核苷酸序列。14.ー种在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的Sirtuin(SIRT)的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少ー种长度为5至30个核苷酸的短干扰RNA(SiRNA)寡核苷酸接触，所述至少ー种siRNA寡核苷酸对Sirtuin (SIRT)多核苷酸的反义多核苷酸具有特异性，其中所述至少ー种siRNA寡核苷酸与所述Sirtuin(SIRT)多核苷酸的反义和/或有义核酸分子的至少约5个连续核酸的互补序列具有至少50%序列同一性；和在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的Sirtuin(SIRT)的功能和/或表达。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述寡核苷酸与同所述Sirtuin(SIRT)多核苷酸的所述反义和/或有义核酸分子互补的至少约5个连续核酸的序列具有至少80 %序列同一性。16.ー种在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的Sirtuin(SIRT)的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少ー种对Sirtuin(SIRT)多核苷酸的有义和/或天然反义链的非编码和/或编码序列具有特异性的长度约5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种反义寡核苷酸与至少ー种如SEQ ID NO :1至14所述的核酸序列具有至少50%序列同一性；和在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的所述Sirtuin(SIRT)的所述功能和/或表达。17.—种经过修饰的合成寡核苷酸，其包含至少ー个修饰，其中所述至少ー个修饰选自至少ー个经过修饰的糖部分、至少ー个经过修饰的核苷酸间键联、至少一个经过修饰的核苷酸和其组合；其中所述寡核苷酸是与正常对照相比在体内或体外与Sirtuin(SIRT)杂交并且调节Sirtuin(SIRT)的功能和/或表达的反义化合物。18.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述至少一个修饰包括选自由以下组成的组的核苷酸间键联硫代磷酸酷、烷基膦酸酷、ニ硫代磷酸酷、烷基硫代膦酸酷、氨基磷酸酷、氨基甲酸酷、碳酸酯、磷酸三酷、氨基こ酸酷、羧甲基酯和其组合。19.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少ー个硫代磷酸酯核苷酸间键联。20.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键联的骨架。21.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·克拉德，O·霍克瓦舍曼，
申请(专利权)人：OPKOCuRNA公司，
类型：发明
国别省市：