本发明专利技术公开了一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：1)淡水鱼鲢鱼小清蛋白标准品的制备；2)抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的制备；3)抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的生物素标记；4)鱼类小清蛋白竞争性ELISA检测方法的建立；5)待检样品中鱼类小清蛋白的检测。本发明专利技术能实现对食品中痕量鱼类小清蛋白的检出。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，特别涉及淡水鱼小清蛋白的特殊制备工艺及检测方法。
技术介绍
食物过敏(food allergy)已成为全世界重要的健康问题。尽管各种食物都可能引发人体产生过敏反应，目前公认的“主要致敏食物”是指那些能引发机体产生严重不良反应的八大类食物，包括牛奶、鸡蛋、花生、坚果、甲壳类动物、鱼类、小麦和大豆。虽然现代生物及医学相关技术日新月异，但目前应对食物过敏最有效的预防方法仍是严格避免摄入过敏原。因此，对于过敏患者来说，了解食物的确切组分，特别是潜在的致敏成分或污染物尤其重要。为了保护消费者，欧盟、美国、加拿大、英国等国家颁布了一系列关于规定食物组分标签方面的法案。我国目前虽然还没有相关法规出台，但在奥运会期间为了保证运动员和裁判员等的健康和饮食安全，奥运组委会通过了一项奥运期间特殊的管理规章，即要求对供应的食品中存在的过敏原进行明确标识。该临时规章的设立表明，尽管现在在全国范围推行过敏原标识的法规时机尚未成熟，但在食品中明确标识过敏原的重要性已具有一定的认知基础，国内相关法规的出台也指日可待。目前，以蛋白质或核酸为检测对象包括双抗夹心ELISA、PCR、SDS-PAGE等方法广泛应用于多种食物过敏原的检测，如甲壳类动物、软体动物、花生、鸡蛋、大豆、牛奶等。但对鱼类过敏原的分析方法仍较为缺乏，尚无有效的对小清蛋白进行定量检测的商品化ELISA试剂盒。另外，由于过敏原的免疫学特性不仅和来源的种属有关，不同的人群由于体质的区另IJ，对同一过敏原的反应也有较大的差异，因此，很有必要根据我国水产品食用情况及人群体质，开发适用于本国人群的过敏原检测试剂盒。我国是鱼类特别是淡水鱼类生产和消费大国。根据农业部渔业局2010年统计数据，2009年全国水产品产量约为5116万吨，其中，鱼类的产量就达到2990万吨，为水产品总产量的58.4%，淡水养殖鱼类(1957万吨)更是占了养殖鱼类(2725万吨)总产量的71.8%。鱼类的主要过敏原为小清蛋白(parvalbumin, PV)。研究表明，小清蛋白在不同鱼类中的同源性很高，因此，以小清蛋白为检测对象，建立对淡水鱼过敏原的灵敏检测方法在我国具有重要的应用价值。但以往对小清蛋白的主要从性质上进行研究，纯化小清蛋白的得率低，或者采用加热的方式，未能得到天然的小清蛋白，均不利于后期检测试剂盒的开发。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了； 本专利技术能实现对食品中痕量鱼类小清蛋白的检出。为了达成上述目的，本专利技术的解决方案是，包括以下步骤I)淡水鱼鲢鱼小清蛋白标准品的制备将鲢鱼白色肉于Tris-HCl缓冲液中组织捣碎，离心得到的上清用硫酸铵盐析后，采用离子交換柱过柱收集未吸附部分进行浓缩，然后利用凝胶过滤柱层析后得到纯化后的鲢鱼小清蛋白标准品；2)抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的制备将纯化的鲢鱼小清蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合后，筛选获得能分泌抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的细胞株，经腹水诱生法获得大量的单克隆抗体；并通过Protein G Sepharose亲和柱进行纯化；3)抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的生物素标记将单克隆抗体经HiTrap脱盐柱处理，将生物素和经HiTrap脱盐柱处理后的单克隆抗体混匀，于冰上孵育得到生物素标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体； 4)鱼类小清蛋白竞争性ELISA检测方法的建立将步骤I)纯化后的鲢鱼小清蛋白标准品，配成浓度为200ng/孔，进行96孔板包被；同时采用O. 625 10240ng/mL浓度范围内的步骤I)纯化后的鲢鱼小清蛋白标准品为样品和分别与等体积步骤2)制备的生物素标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体同时加入到96孔板包被孔中孵育；以辣根过氧化物酶标记的亲和素(Sigma)为ニ抗进行检测，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大ー抗(生物素标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体)的信号。以3，3’，5，5’-四甲基联苯月安(3, 3’，5, 5’-tetramethylbenzidine,TMB)作为显色剂,用H2SO4终止后,测定吸光值;并绘制标准曲线。5)待检样品中鱼类小清蛋白的检测待检样品按照步骤3)的方法进行处理并进行稀释，稀释的目的是使待检样品中小清蛋白的浓度进行准确定量，当其測定的OD值位于标准曲线线性区域内；即为待检样品中有小清蛋白检出，反之既为未检出。本专利技术的检测方法是基于竞争性ELISA的实验方法，以高质量的鲢鱼小清蛋白为抗原为基础，联合竞争性ELISA法的优势，使本专利技术的检测灵敏度进ー步提高。所述的步骤I)具体为将鲢鱼白色肉于4倍体积pH 7. 5，20mmol/L Tris-HCl缓冲液中组织捣碎，经离心得到的上清用60 100%饱和度的硫酸铵盐析；盐析后的沉淀再次溶于20mmol/L Tris-HCl缓冲液中透析,透析后的样品上样于预先用pH 7. 5, 20mmol/LTris-HCl平衡的DEAE-Sepharose离子交换柱(Amersham Biosciences),收集未吸附部分进行浓缩后，上样于Sephacryl S-200凝胶过滤柱(Amersham Biosciences)层析,纯化后即得到鲢鱼小清蛋白标准品。所述的步骤I)中，DEAE-S印harose离子交换柱洗脱时，洗脱液为20mmol/LTris-HCl缓冲液，流速lmL/min，由于目的蛋白与离子交换树脂存在极微弱的吸附特性，根据这ー特性控制流洗时间可高效除去杂蛋白的干扰，并使目的蛋白得到浓缩。所述的步骤3)具体为将纯化的单克隆抗体经HiTrap脱盐柱处理，其中采用含NaCl的PBS作为流洗液；然后以摩尔比为100 I的比例将生物素和经HiTrap脱盐柱处理后的单克隆抗体混匀，于冰上孵育2h得到生物素标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体；并再次通过HiTrap脱盐柱去除未结合的生物素；本过程采用生物素标记的抗体对于本专利技术所制备的淡水鱼小清蛋白的检测灵敏度非常重要，因为生物素与亲和素的特异性相互作用可使检测信号有效放大，从而大大提高检测体系的灵敏度。所述的PBS的配方为含有O. 15mol/L NaCl的pH 7. 2的O. lmol/L PBS，所述的生物素溶液采用超纯水配成IOmM的生物素溶液。所述的步骤4)具体为利用所述的步骤I)纯化后的鲢鱼小清蛋白标准品，配成浓度为200ng/孔进行96孔板包被，然后用TBST洗涤5次后，以5%脱脂奶封闭，再用TBST洗涤5次；然后配制6-10个浓度在0. 625 10240ng/mL范围内的步骤I)所制备的鲢鱼小清蛋白标准品为样品分别与等体积步骤2)所制备的生物素标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体，于37°C加入到96孔板包被孔中孵育Ih ;然后用TBST洗涤5次后，以辣根过氧化物酶标记的亲和素为二抗进行检测；再使用TBST洗涤5次后，以3，3’，5，5’_四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB)作为显色剂，用2M H2SO4终止后，在96孔板酶标仪测定450nm的吸光值；将标准品各浓度的OD值换算成:其中B为标准品各浓度在450nm的OD值，Btl是空白对照的OD值；然后以为纵坐标，相应的标准品各浓度的对数值为横坐标即可绘制标准曲线。所述的TBST 由 20m本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤 1)淡水鱼鲢鱼小清蛋白标准品的制备将鲢鱼白色肉于Tris-HCl缓冲液中组织捣碎，离心得到的上清用硫酸铵盐析后，采用离子交换柱过柱收集未吸附部分进行浓缩，然后利用凝胶过滤柱层析，得到纯化后的鲢鱼小清蛋白标准品； 2)抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的制备将纯化的鲢鱼小清蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合后，筛选获得能分泌抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的细胞株，经腹水诱生法获得大量的单克隆抗体；并通过Protein G Sepharose亲和柱进行纯化； 3)抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的生物素标记将单克隆抗体经HiTrap脱盐柱处理，将生物素和经HiTrap脱盐柱处理后的单克隆抗体混匀，于冰上孵育得到生物素标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体； 4)鱼类小清蛋白竞争性ELISA检测方法的建立鱼类小清蛋白竞争性ELISA检测方法的建立将步骤I)纯化后的鲢鱼小清蛋白标准品，配成浓度为200ng/孔，进行96孔板包被；同时采用0. 625 10240ng/mL浓度范围内的步骤I)纯化后的鲢鱼小清蛋白标准品为样品和分别与等体积步骤2)制备的生物素标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体同时加入到96孔板包被孔中孵育；以辣根过氧化物酶标记的亲和素为二抗进行检测，以3，3’，5，5’-四甲基联苯胺作为显色剂，用H2504终止后，测定吸光值；并绘制标准曲线； 5)待检样品中鱼类小清蛋白的检测待检样品按照步骤3)的方法进行处理并进行稀释，当其测定的OD值位于标准曲线线性区域内；即为待检样品中有小清蛋白检出，反之既为未检出。2.如权利要求I所述的一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法，其特征在于所述的步骤I)具体为将鲢鱼白色肉于4倍体积pH 7. 5,20mmol/L Tris-HCl缓冲液中组织捣碎，经离心得到的上清用60 100%饱和度的硫酸铵盐析；盐析后的沉淀再次溶于20mmol/L Tris-HCl缓冲液中透析,透析后的样品上样于预先用pH 7. 5, 20mmol/L Tris-HCl平衡的DEAE-Sepharose离子交换柱，收集未吸附部分进行浓缩后，上样于Sephacryl S-200凝胶过滤柱层析，纯化后即得到鲢鱼小清蛋白。3.如权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡秋凤，曹敏杰，刘光明，苏文金，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：
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