本发明专利技术属于生物分子检测技术领域，具体为一种高灵敏检测t-DNA的SERS液相芯片方法。本发明专利技术以表面增强拉曼光谱（SERS）为编码，磁性复合纳米粒子为捕获基底的SERS液相芯片用于高灵敏的检测t-DNA。首先以SERS编码的纳米粒子（SERS标签）化学结合探针p-DNA，制备高灵敏的SERS探针；以表面富含羧基的磁性复合纳米粒子化学结合捕获c-DNA制备了磁性捕获基底。然后使用SERS探针和磁性捕获基底构建SERS液相芯片方法来检测t-DNA。本发明专利技术方法操作简单、快捷、灵敏，可实现对DNA的高通量、定量、多元检测，可广泛用于食品安全监测、医学诊断、法医检验等领域，具有重要的应用前景和开发价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分子检测
，具体涉及。
技术介绍
DNA分子的检测在基因治疗、食品安全监测、医学诊断、法医分析、文物鉴定等领域具有重要的应用价值。目前，使用最多的检测方法是荧光光谱法。但是荧光易于淬灭导致荧光信号的重现性极差。另外荧光发射光谱较宽(有机荧光染料的半高谱宽为50 100nm，量子点的半高谱宽为25 40 nm)，导致发射光谱易重叠，因而荧光光谱的分辨率很低(Sun, L. ; Yu, C. X. ; Irudayaraj, J. Anal. Chem. 2007，79，3981-3988)。与荧光光谱相比，表面增强拉曼散射光谱(SERS)在DNA检测方面具有如下优势一、SERS光谱能够 提供丰富的分子振动信息，SERS光谱谱峰狭窄(半高宽约I nm)，因而SERS光谱具有很高的光谱分辨率。二、拉曼活性分子光稳定性高，SERS信号的重现性好(Mulvaney，S. P.;Musick, M. D. ; Keating, C. D. ; Natan, M. J. Langmuir 2003, 19, 4784-4790)。因此，目前SERS光谱已逐渐取代了荧光光谱，成为生物分析领域普遍应用的检测方法。应用SERS光谱检测DNA的基本方法是“三明治”杂化分析法，目前常用的固定基底是片膜芯片。Mirkin课题组首先将一端具有巯基和一端结合了拉曼活性分子的p-DNA吸附到金纳米粒子表面制成SERS探针，并将平面芯片共价结合c-DNA制成捕获基底，然后采用“三明治”杂化分析方法检测t-DNA。实验结果得到检测限为20 fM，而且该方法具有较高的选择性和光谱分辨率，并能够检测单个碱基错配的DNA序列(Cao，Y. ff. C. ; Jin,R. C. ; Mirkin, C. A. Science 2002, 297，1536-1540)。fcaun 等将光滑的银纳米膜结合c-DNA作为捕获基底，当形成杂化复合物后，SERS探针中的银纳米粒子与银纳米膜基底紧密靠在一起产生巨大的 SERS 信号(Braun, G. ; Lee, S. J. ; Dante, M. ; Nguyen, T.Q. ; Moskovits, M. ; Reich, N.J. Am. Chem. Soc. 2007，129，6378-6379)。片膜芯片固定基底制备方法简单，但是存在以下缺点(1) DNA链之间的杂交反应在固相中进行，大大降低了 DNA链之间的杂交效率；(2)片膜芯片的比表面积较小，大大限制了 c-DNA的结合容量；(3)由于c-DNA结合在整个芯片表面，因而SERS探针平均分布在整个基底表面(远远大于SERS检测的激光光斑面积)，从而分散了 SERS探针的信号强度，降低了检测灵敏度。因此，开发简便、高效、高灵敏和高通量的DNA检测方法仍是近年研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简便、高效、高灵敏检测t-DNA的SERS液相芯片方法。本专利技术针对
技术介绍
中所存在的问题，提出了一种采用具有高灵敏度和高稳定性的SERS编码微球为SERS探针，具有高比表面积和快速磁响应性的磁性复合纳米粒子为固定基底的SERS液相芯片检测t-DNA的方法。磁性复合纳米粒子具有快速的磁响应性能、良好的生物相容性能和较高的DNA捕获容量和效率；基于SERS探针和磁性复合纳米粒子构建的SERS液相芯片方法具有高检测灵敏度、高定量检测能力和高多元检测能力。本专利技术是通过以下三步技术方案实现的，第一步制备SERS探针首先使用氨基硅烷偶联剂为功能化合物，采用溶胶凝胶方法将包覆二氧化硅壳层的SERS标签的表面改性为氨基基团，然后利用氨基和丁二酸酐的开环反应，得到表面修饰羧基的SERS标签，最后利用SERS标签表面的羧基与p-DNA末端的氨基发生酰胺化反应得到SERS探针。第二步制备磁性捕获基底通过碳二亚胺方法使磁性复合纳米粒子表面的羧基和c-DNA末端的氨基发生酰胺化反应得到磁性捕获基底。第三步构建SERS液相芯片方法使用t-DNA与匹配的SERS探针和磁性复合纳米粒子构建SERS液相芯片在溶液中采用“三明治”杂化分析方法检测t-DNA (如图I所示)。本专利技术提供的，具体步骤如下 I.制备SERS探针 将壳层为二氧化硅的高稳定性和生物相容性的SERS标签微球分散在水和乙醇的混合溶液中，再加入氨水和一定量的氨基硅烷偶联剂，超声乳化0. 2 2h，超声功率为400 800W，得到表面修饰氨基的SERS标签微球。然后将上述表面修饰氨基的SERS标签，丁二酸酐和溶剂N，N' - 二甲基甲酰胺(DMF)加入单口烧瓶，在室温下磁力搅拌反应5 20 h后，用水和乙醇离心洗涤除去过量的试剂，得到表面修饰羧基的SERS标签。最后将表面修饰羧基的SERS标签与酰胺化反应催化剂，p-DNA的磷酸缓冲溶液(PBS)混合，在室温下的摇床中孵化2 20 h，得到的SERS探针用PBS离心洗涤除去过量的试剂，再分散在含氯化钠的PBS溶液中配成粒子含量为0. 5 wt%的分散液。2.制备磁性捕获基底 将磁性复合纳米粒子与酰胺化反应催化剂、c-DNA的磷酸缓冲溶液(PBS)混合，在室温下的摇床中孵化2 20 h，得到的磁性捕获基底用PBS磁分离洗涤除去过量的试剂，然后分散在含有氯化钠的PBS溶液中配成粒子含量为0. 5 wt%的分散液。3. SERS液相芯片检测 将SERS探针与溶解于含有NaCl的PBS溶液的t_DNA混合，在10 60°C的摇床中孵化2 10 h，然后加入磁性捕获基底在10 60°C的摇床中继续孵化2 10 h，得到“三明治”式杂化复合物，再用PBS磁分离洗涤除去物理吸附的SERS探针，最后用外加磁场富集后进行Raman测定。本专利技术中所述的氨基硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)中的一种。本专利技术中，步骤I中所述的氨基硅烷偶联剂的用量为0. I 10g/g SERS标签微球。本专利技术中，步骤I和步骤2中所述的酰胺化反应催化剂为I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)溶液、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中的一种或两种。本专利技术中，步骤I中所述的丁二酸酐用量为0. I 10g/g SERS标签微球，酰胺化反应催化剂用量为I 100g/g SERS标签微球，探针P-DNA浓度为0. I 100 u M。本专利技术中，步骤2中所述的酰胺化反应催化剂用量为I 100g/g磁性复合纳米粒子，捕获c-DNA浓度为0. I 100 u M0本专利技术中，步骤I中所述的SERS标签的制备方法采用专利(公开号CN102206357A)报道的方法。本专利技术中，步骤2中所述的磁性复合纳米粒子是一种表面羧基功能化的核壳式磁性复合微球，其制备采用专利(申请号201110274619. 8)报道的方法。本专利技术中，步骤I中二氧化硅的SERS标签微球是以4-氨基苯硫酚、4-氯苯硫酚或5,5 ; - 二硫代双(2-硝基苯甲酸)为拉曼探针分子的SERS标签。本专利技术采用SERS编码的SERS探针和纳米级别的磁性复合纳米粒子构建的SERS液相芯片方法克服了平板芯片方法DNA链之间杂交效率低、捕获c-DNA的结合数量少、检测灵本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高灵敏检测t-DNA的SERS液相芯片方法，其特征在于具体步骤如下 (1)制备SERS探针将壳层为二氧化硅的SERS标签微球分散在溶剂中，加入氨水和氨基硅烷偶联剂，超声乳化得到表面修饰氨基的SERS标签微球，其中，所述氨基硅烷偶联剂和壳层为二氧化硅的SERS标签微球的质量比为(0. I 10) : I ;然后将上述表面修饰氨基的SERS标签微球、丁二酸酐溶于N，N' - 二甲基甲酰胺，室温搅拌，离心，洗涤，得到表面修饰羧基的SERS标签，其中，所述丁二酸酐和表面修饰氨基的SERS标签微球的质量比为(0. I 10) :1 ;最后将表面修饰羧基的SERS标签与酰胺化反应催化剂、浓度为0. I 100 ii M的p-DNA的磷酸缓冲溶液混合，室温孵化2 20 h，离心，洗涤，再分散在含氯化钠的磷酸缓冲溶液中配成分散液，其中所述酰胺化反应催化剂和SERS标签微球的质量比为(I 100) :1 ； (2)制备磁性捕获基底将磁性复合纳米粒子与酰胺化反应催化剂、浓度为0.I IOOuM的c-DNA的磷酸缓冲溶液混合，室温孵化2 20 h，分离洗涤，然后...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪长春，李菊梅，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：
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