本发明专利技术公开了一种莜麦病程相关蛋白的基因及其编码的蛋白。是应用RT-PCR及3'RACE技术从莜麦幼苗中分离出了一个678bp的病程相关蛋白基因，该基因的核苷酸序列为：SEQID?No：1。该基因编码的蛋白的氨基酸序列为：SEQ?ID?No：2。本发明专利技术的莜麦病程相关蛋白的基因，可用于培育抗病作物；该基因编码的蛋白，可用于开发绿色抑菌剂等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物中与抗病害相关的基因序列及其编码的氨基酸序列，尤其涉及莜麦(裸燕麦)的一种病程相关蛋白基因序列。
技术介绍
植物在其生长发育过程中会受到一些病原微生物的侵袭，常可诱发植物产生抗病机制。从作用方式看，植物产生的抗病机制可分为3种形成障碍物以阻止病原菌的侵染和扩散；产生具有抑菌活性的物质以杀死病原体；产生一些酶或化学物质以解除致病因子。 病程相关蛋白(pathogenesis related proteins,PRP / PRs)就是植物在病理或病理相关的条件下产生的一类蛋白，具有广谱抗性。它最初是由Van Loon和Van Ka_en等人应用多聚腺苷酸诱导烟草抗病研究时发现的，称为b蛋白。随着研究的不断深入，在许多植物中都发现了该类蛋白，并将其命名为病程相关蛋白。植物在外界因素(如病原因素、化学和物理因素等)以及自身生理因素(如开花、落叶、衰老等)影响下常会产生或积累PRP，其主要分布于植物的细胞间隙和液泡内，相对分子量较小，一般为10-40kD。PRP的稳定性较好，能抵抗蛋白酶、糖苷酶、重金属、尿素、低pH值和高温(60°C )等。已报道的PRP大部分是植物抗病原微生物时产生的，但也有些是由化学或物理条件诱导产生的，其主要功能包括攻击病原物、分解毒素、结合或抑制病毒外壳蛋白。按氨基酸序列的相似度可将PRP分为以下5类(1)PR-1类，富含甘氨酸，该类蛋白在TMV侵染烟草过敏反应中产生的。(2)PR-2和PR-3类，分别具有P _1，3-葡聚糖酶和几丁质酶活性。(3)PR-4类，有保守的Barwin domain，N端有信号肽。(4)PR_5类，被称为类甜蛋白(Thaumatin-Iike proteins),是一类具有多种生物学活性及重要功能的植物防御蛋白。通常该类蛋白具有葡聚糖酶活性，能结合并降解真菌细胞壁，该功能与其表面的酸性“V”字形裂缝有关。(5) PR-IO类，有核酸酶相似结构，部分显示体外核酸酶活性和抗菌活性。莜麦(又称裸燕麦)是晋西北地区主要的粮食作物之一，在禾谷类作物中蛋白质含量最高，含有人体必需的8种氨基酸，且组成也较平衡。长期食用莜麦不仅能预防高血压、高血脂等心脑血管疾病，而且对糖尿病的预防及治疗也有一定的作用。本专利技术从莜麦幼苗中分离到一种病程相关蛋白基因，该基因编码的蛋白属于PR-5类病程相关蛋白，已有报道在玉米、高梁、小麦等种子中发现了该类蛋白，分子量约为23KD。该类蛋白常具有抗真菌、￠-1,3-葡聚糖酶、抗冻、抗渗透压力等多种生物学活性，参与植物系统获得性反应(SAR)和超敏反应(HR)，在植物抵御生物和非生物胁迫中具有重要作用。PR-5蛋白能导致真菌孢子裂解，抑制孢子萌发，降低萌芽的生存能力，消耗细胞膜的势能，抵抗不同的致病和非致病真菌。研究发现，酵母细胞膜表面存在一种PR-5蛋白的受体(Izh2p),从而导致细胞程序性死亡，该PR-5蛋白受体在真菌是保守存在的，这使的PR-5蛋白被认为是一种新颖的、广谱的、具有潜力的抑菌药物。此外，对转PR-5基因作物的研究发现，与野生作物相比，转基因作物对环境胁迫的适应能力，尤其是抗盐溃、干旱和病菌侵害的能力都有显著的提高，这也进一步证实了 PR-5蛋白的应用价值。另外PR-5蛋白还与毫无氨基酸序列同源性的动物脂联素(adiponectin)具有相似的功能——能通过哺乳类C2C12肌细胞的脂联素受体诱导AMP激酶的磷酸化作用，这一研究发现使得PR-5蛋白的应用前景更为广阔。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供莜麦中的一种PR-5类病程相关蛋白基因及其编码的蛋白，本专利技术的另一目的在于将莜麦病程相关蛋白的基因在培育抗病作物中应用，将莜麦病程相关蛋白在制备抑囷剂中应用。本专利技术提供的一种莜麦病程相关蛋白(permatin)的基因,其核苷酸序列为SEQID No :1，来源于莜麦(A. nuda)，由678个碱基组成。莜麦病程相关蛋白(permatin)的基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No 2，由225个氨基酸组成。蔽麦病程相关蛋白基因的获得I)根据 NCBI 中 permatin precursor [Avena sativa](登录号为 ASU57787) DNA序列设计引物正向引物IaaUp5’ -CTGGATCCATGGCGTCCTCCAGTGTC-3’反向引物184aaDn5’ -GTCGGTGAACTGGCCCCGGCA-3’以莜麦(A. nuda)幼苗叶片总RNA为模板，在laaUp/184aaDn引物引导下进行RT-PCR ；2)根据已获取的permatin基因5’端cDNA序列设计特异性引物124aaUp,利用3’ RACE技术扩增permatin基因cDNA 3’末端；3)利用重叠PCR获得permatin基因的全长核苷酸序列。将该基因全长经Blast比对，结果表明其与禾本科植物类甜蛋白(Thaumatin-like proteins, TLP)有较高的同源性,具有PR-5类蛋白的共同特征,归属于PR-5类病程相关蛋白，在培育抗病作物中潜在的应用价值。莜麦重组病程相关蛋白的获得将5’和3’端分别含有EcoR I和BamH I酶切位点的PCR产物克隆至含相应酶切位点的原核表达载体pMAL-2c中，构建成重组质粒pMAL-2c-permat in,转E. Coli BL21感受态细胞中，IPTG诱导表达重组蛋白，并进行纯化。蔽麦重组病程相关蛋白抑菌实验用牛津杯法鉴定permatin蛋白对白腐菌、毛壳菌、红曲霉三种真菌的抑制作用，表明该蛋白具有很好的抗菌效果，在开发绿色抑菌剂方面有潜在的应用价值。本专利技术的莜麦病程相关蛋白的基因，可用于培育抗病作物；该基因编码的蛋白，可用于开发绿色抑菌剂等。附图说明 图I为莜麦幼苗叶片总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果图2为RT-PCR及3’ RACE实验PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果泳道I :DNAMarker ;泳道2 :laaUp/184aaDn 引物扩增产物；泳道3 124aaUp/InnerPrimer引物扩增产物。图3为搭桥PCR扩增permatin全长cDNA琼脂糖凝胶电泳检测结果泳道I :DNA Marker ;泳道 2-3 laaUp/228aaDn 引物扩增产物。图4为不同来源的PRP氨基酸序列比对结果Triticum aestivum TLP (GenBank 登录号为 AAM15877. I) ；0ats permatinprecursor (GenBank 登录号为 AAB02259. I) ;Barley TLP7 (GenBank 登录号为 548125);Zeamatin precursor (RefSeq 登录号为 NP 001105356. I) ；Barperml (GenBank 登录号为AAB71680. I)。图5为重组融合蛋白纯化过程12%SDS_PAGE 泳道I :Pix)tein Marker ;泳道2 :诱导全菌样；泳道3 :诱导上清样；泳道4 :诱导沉淀样；泳道5 Amylose柱穿透样；泳道6 :麦芽糖洗脱样；泳道7 Sephacryl-200凝胶层析柱纯化样。图6为permatin蛋白体外抑菌实验本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种莜麦病程相关蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQ ID N2 :1。2.权利要求I所述的基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQID ...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩德平，石亚伟，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：
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