本发明专利技术属于基因工程技术领域，涉及小麦耐盐、抗旱WRKY转录因子基因TaWRKY79的克隆及其应用。本发明专利技术公开了一种小麦耐盐、抗旱WRKY转录因子基因TaWRKY79及其在培育耐盐、抗旱植物中的应用。实验证明，本发明专利技术所述转基因植株的耐盐、抗旱能力明显提高。本发明专利技术的基因在培育耐盐、抗旱植物（特别是作物）中具有重要作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，涉及小麦耐盐、抗旱WRKY转录因子基因TaMKY79 的克隆及其应用。
技术介绍
近年来土壤盐溃化及水资源短缺是制约农业生产的一个全球性问题。盐害与干旱不仅严重影响植物的生长发育，造成作物减产，而且使生态环境日益恶化(Saibo et al.， Annals of Botany, 2009, 103 (4) :609-623)0因此，提高作物的抗旱和/或耐盐能力已经成为现代作物育种工作急需解决的关键问题之一。分离克隆耐盐基因，培育耐盐新品种已成为全世界的研究热点之一。小麦是重要的农作物，克隆耐盐、抗旱基因，培育耐盐、抗旱小麦新品种已成为当前一个十分迫切的任务。目前利用基因工程技术开展植物耐盐、抗旱方面的研究已取得了较大的的进展。 一些实验表明，将植物本身以及其他生物中与耐盐相关的基因转入植物中，可以使转基因植物的抗盐能力提高(Chinnusamy et al. , Crop science, 2005, 45:437-448·) 。转录因子在基因表达和环境胁迫响应中起着关键的调控作用。目前，已发现了一些能显著提高植物耐盐能力的转录因子。研究表明，将这些基因转化到植物中，可以明显提高植物的耐盐能力(Nakashima K. , Plant Physiology, 2009, 149: 88 - 95·)。WRKY是一个转录因子家族，其成员广泛参与植物的正常生长发育和对各种环境胁迫的响应过程。转基因研究实验表明过表达一些WRKY转录因子基因可提高转基因植株的耐盐和耐旱性。例过表达大 的GmWRKY54基因可使转基因拟南介的耐盐和耐旱性提闻 (Zhou et al. , Plant Biotechnology Journal, 2008, 6, 486-503.) 将大麦的//FfSXTJS 转入牧草可提高转基因牧草的生物量和耐旱性(Xiong et al. , Molecular Breeding, 2010, 25: 419 - 432.)。AtWMY25、AtWRKY33过表达拟南芥也增加了对盐胁迫的耐受性。 目前有关小麦WRKY转录因子在耐盐方面的研究还非常有限，Niu et al研究表明过表达和可提高转基因拟南芥的耐盐和耐旱性(Niu et al.，Plant cell and environment, 2012)。进一步克隆小麦耐盐、旱相关基因，通过基因工程培育小麦耐盐、耐旱新品种非常重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供了一种首次从小麦中分离出一个耐盐、抗旱的WRKY转录因子基因，命名为将该基因连接到过表达载体pCAMBIA super 1300上，利用农杆菌浸染法转化拟南芥，获得的转基因拟南芥植株的生物量、耐盐性、抗旱能力均比未转基因对照植株提高。本专利技术的技术方案为一种小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY79，TaWRKY79基因的cDNA 序列如SEQ ID No. I所示,氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。本专利技术小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY79的制备方法首先根据小麦的基因芯片表达谱数据选出在小麦幼苗根中受盐胁迫显著上调表达的WRKY转录因子基因(探针)，然后根据探针序列设计基因特异性引物，进一步从小麦根的全长cDNA文库中克隆其全长cDNA，最后构建过表达载体转化到拟南芥中进行功能研究。I.引物设计根据芯片探针序列设计基因特异性的下游引物Wrkyl-1:5丨-GCTGCATCCACTCTAGAATGT CG-3'，与文库的5'端锚定引物NT3 :5’ -ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG-3’进行配对，以小麦幼苗根的全长cDNA文库为模板扩增基因的全长cDNA。 2. PCR反应体系(50μ L)及程序 2 X GC buffer I25 μ I 模板cDNA文库 Iul dNTPs (IOmM each) I μ I Primerl (10 μ Μ) I μ I Primer2(10 μ Μ) I μ ILA Taq (TaKaRa)O. 5ulddH20加至终体积50 μ I94°C 预变性 3min ;94°C变性 45sec，58°C复性 lmin，72°C延伸 2min，循环 35 次；72°C 延伸5min。3. 1%琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测后发现在IOOObp处有一条目的条带(图I)。4.扩增片段的回收、与T载体的链接对扩增条带采用Tiangen公司的琼脂糖胶回收试剂盒，步骤按说明书进行。PCR产物与 pGEM-T (Promega)载体连接,连接体系为回收的PCR产物7μ110 X Τ4连接酶缓冲液 μ pGEM-T 载体(50ng/ μ I) μ T4DNA 连接酶(3U/ μ I) (Takara) μ 于4 °C冰箱连接过夜。5.回收片段的克隆与测序用CaCl2法制备大肠杆菌DH5a (购自天为时代生物公司)感受态细胞，42°C水浴热激法进行转化。向转化后培养Ih的菌液中加入X-gal和IPTG，混匀，用涂布器将其均匀涂到含有氨苄青霉素的平板上，37°C恒温倒置培养过夜，待出现明显单菌落时将平板拿出。根据所用pGEM-T载体克隆位点两端的T7启动子和SP6启动子序列设计通用引物 T7，SP6对重组克隆进行PCR鉴定。PCR 程序94°C 预变性 IOmin ;94°C变性 lmin，58°C复性 lmin，72°C延伸 lmin，循环35次；72°C延伸5min ；PCR扩增产物用1%琼脂糖电泳检测，取阳性克隆的菌液送公司进行测序。测序结果见 SEQ ID No. I。本专利技术还提供小麦耐盐、抗旱基因在培育耐盐、抗旱植物中的应用。尤其是在普通小麦、玉米和水稻植物中的应用。本专利技术的有益效果是本专利技术首次克隆得到了小麦WRKY转录因子基因TaWRKY79, 将该基因连接到过表达载体pCAMBIA super 1300上，利用农杆菌浸染法转化拟南芥，获得的转基因拟南芥植株的生物量、耐盐性、抗旱能力均比未转基因对照植株明显提高。附图说明图I 7 腸基因全长cDNA序列的扩增结果。M :DNA分子量marker。图2不同处理条件下TaWRKY79基因在小麦山融3号幼苗根和叶中的RT-PCR表达分析。TaActin为内参；leaf :叶；root :根。图3构建的植物表达载体pCAMBIA_superl300/TaWRKY79的酶切验证结果。图4转基因拟南芥的PCR鉴定。1，2，6:不同的转 基因拟南芥株系，Col-O野生型拟南芥。图5转基因拟南芥株系的表型鉴定。A、B :正常生长条件下对照和转基因株系的表型。C :不同处理条件下植株的表型。D-H :不同处理条件下对照及转基因株系植株根长统计结果。I :野生型拟南芥和TaWRKY79转基因拟南芥不同株系干旱2周、复水3天后的表型。具体实施例方式实施例I、TaWRKY79基因cDNA序列的克隆I.引物设计根据芯片探针序列设计基因特异性的下游引物Wrkyl-1:5丨-GCTGCATCCACTCTAGAATGT CG-3'，与文库的5'端锚定引物NT3 :5’ -ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG-3’进行配对，以小麦幼苗本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种小麦耐盐、抗旱基因TamKY79，其特征在于所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No. I 所示。2.如权利要求I所述的一种小麦耐盐、抗旱基因其特征在于所述转录因子基因编码的蛋白质，其氣基酸序列为...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦余香，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：
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