基于多孔材料的核酸等温扩增试剂的保存方法及试剂技术

本发明专利技术涉及一种基于多孔材料的核酸等温扩增试剂的保存方法及试剂，所述的保存方法是在一种或几种核酸等温扩增反应液的组分中添加多孔材料进行保存。本发明专利技术方法处理后的核酸等温扩增反应液的组分可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。本发明专利技术的方法具有工艺简单、成本低廉的特点，采用本发明专利技术方法处理后的等温扩增反应试剂混合物在便利的贮存条件下具有活性稳定持久的优点，这在大大降低等温扩增反应试剂的贮运成本的同时，还为等温扩增反应的实际操作带来极大的便利。该发明专利技术必将有力促进等温扩增技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于等温扩增技术的诊断或检测试剂产品的大规模推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物试剂保存
，具体涉及一种生化试剂组合物的保存方法，确切地说是分子生物学中核酸等温扩增反应试剂及其混合物的常温保存方法，以及采用该方法制作的可以常温保存和运输的反应试剂。
技术介绍
在过去的20年里，以多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)为代表的核酸扩增技术得到了迅猛的发展和应用。最近几年，产生了一系列新型的核酸等温扩增技术，这些技术或基于DNA/RNA生物合成机制研究的新发现，或者利用具有特殊功能的核酸酶来实现恒温条件下对目标核酸的扩增；无论在实际操作还是在仪器要求方面，这些等温扩增技术都比PCR技术更简单和廉价，从而更容易被开发和利用，尤其是在核酸检测及诊 断领域，等温扩增技术正逐渐成为PCR技术的替代方法而被广泛应用。利用等温扩增技术开发的各类检测及诊断产品在特异性、易用性、成本和方便性等方面具有PCR技术产品无可比拟的优势，市场前景极为广阔。虽然等温扩增技术本身优势明显，但基于等温扩增技术的产品在大规模应用过程中却面临一些问题的困扰，其中最为突出的是产品需要低温冷冻保存和运输。作为核酸扩增技术的一种，等温扩增也需要由具有生物活性的酶的参与，而酶生物活性的长期保持需要低温冷冻条件，同时等温扩增反应所需的寡聚核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和反应缓冲液等均需在冷冻条件下贮存，并且反复冻融会使这些成份失效，所以基于等温扩增技术的产品要求在低温冷冻条件进行运输和保存，这一方面增加了运输成本，另一方面也限制了这些产品在不具备低温保存条件的环境或地区的应用。对于大规模生产、商品化的基于等温扩增技术的产品，为了保证产品的一致性、稳定性和可靠性，也要求尽可能把各种反应试剂一次性添加和分装，并使产品在贮存和运输过程中具备尽可能长的保质期限。因此，专利技术一种能够方便有效保存等温扩增反应试剂混合物的方法具有重要的价值。申请号为200810159414. 3的专利技术专利“环介导等温扩增反应试剂混合物的保存方法”公开了一种在环介导等温扩增反应试剂混合物中添加干燥保护剂 然后进行真空干燥或快速风干实现环介导等温扩增反应试剂混合物常温长期保存的方法，但这种方法需要专门的真空冷冻干燥仪或快速风干机等复杂的设备，还需要消耗大量的能源，并不是一种十分经济的方法。所以，有必要开发新的、更加简便、经济、高效的核酸等温扩增试剂常温长期保存方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于多孔材料的核酸等温扩增反应试剂保存方法及反应试剂，以弥补现有技术的不足。本专利技术的一个方面是提供一种在核酸等温扩增反应试剂中添加多孔材料从而使核酸等温扩增试剂或其混合物在常温或室温长期保存的方法。本专利技术的另一个方面是提供一种采用上述方法制作的核酸等温扩增试剂，以及包含有该反应试剂的试剂盒。本专利技术的保存方法，其特征是在一种或几种核酸等温扩增反应液的组分中添加多孔材料进行保存。上述的核酸等温扩增反应液的组分为核酸等温扩增的聚合酶。上述核酸等温扩增反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和/或三磷酸核苷酸(NTP)、核酸等温扩增聚合酶的反应缓冲液的任一种或几种。上述的核酸等温扩增的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。上述的核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液为核酸序列依赖性扩增的反应缓冲 液、链替代扩增反应缓冲液或环介导等温扩增反应缓冲液。上述的多孔材料在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0. 005% 60%。上述的多孔材料为孔径不小于I纳米的多孔材料。上述的多孔材料为有序多孔材料和/或无序多孔材料。上述的有序多孔材料为微孔材料、介孔材料、大孔材料中的任一种或几种。上述的有序多孔材料为硅藻土、活性炭、氧化铝多孔陶瓷、氧化硅多孔陶瓷、介孔二氧化硅、SBA-15中的一种或几种。上述的无序多孔材料为多孔磷酸盐微晶玻璃、氧化硅凝胶、有机硅聚苯乙烯多孔材料中的一种或几种。上述的硅藻土在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0. 01% 10%，优选为 0. 02% 5%。上述的活性炭在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0. 01% 35%，优选为 0. 02% 35%。上述的介孔二氧化硅在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml 为 0. 01% 20%，优选为 0. 02% 20%。上述的多孔磷酸盐微晶玻璃在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为1%飞0%，优选为5% 50%。本专利技术还涉及一种可在常温下长期保存的核酸等温扩增反应试剂，其特征在于，所述的反应试剂是在一种或几种核酸等温扩增反应液的组分中添加多孔材料制备的。上述的核酸等温扩增反应液为核酸等温扩增的聚合酶、引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液中的任一种或几种。本专利技术还包括一种核酸等温扩增反应试剂盒，该试剂盒包含有上述可在常温下长期保存的核酸等温扩增反应试剂。本专利技术方法处理后的核酸等温扩增反应液的组分(等温扩增反应试剂的单独组分或其混合物)，可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。本专利技术的方法具有工艺简单、成本低廉的特点，采用本专利技术方法处理后的等温扩增反应试剂混合物在便利的贮存条件下(常温或室温等温度条件)具有活性稳定持久的优点，这在大大降低等温扩增反应试剂的贮运成本的同时，还为等温扩增反应的实际操作带来极大的便利。该专利技术必将有力促进等温扩增技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于等温扩增技术的诊断或检测试剂产品的大规模推广应用。说明书附I :固定化的LAMP反应体系在4°C储存下的活性衰减特征图；图2 :固定化的LAMP反应体系在25°C储存下的活性衰减特征图； 图3 :固定化的LAMP反应体系在37°C储存下的活性衰减特征图。具体实施例方式在目前的分子实验、检测操作中，若是直接将核酸等温扩增反应试剂(即核酸等温扩增反应液的组分)如引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)或三磷酸核苷酸(NTP)、聚合酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶和内切酶等)、聚合酶的反应缓冲液(不同类型的等温扩增反应需要不同的聚合酶和反应试剂)等的混合物保存在常温或者室温条件下，通常情况下广2天后这些反应试剂混合物就失去了对目的核酸的扩增能力。研究发现，在常温或室温的条件下，等温扩增反应液(即等温扩增反应试剂混合物)中最容易失去反应活性的是聚合酶，而这些聚合酶丧失活性的主要原因是由于长时间保存、温度过高或温度变化导致酶活性中心维持高级结构的氢键、离子键、二硫键等分子作用力受到破坏所致；同时在常温或室温条件下，等温扩增反应液(即等温扩增反应试剂混合物)中的寡聚核苷酸引物、dNTP也会很快降解，无法参与基因扩增。核酸等温扩增反应试剂中体积较大的有机活性成分如聚合酶(DNA聚合酶和/或RNA聚合酶)、模板核酸、引物等分子质量在I 100千道尔顿(kDa)之间，直径大约介于I 100纳米(nm)。申请人在研究中发现，将多孔材料添加到核酸等温扩增反应液的组分中，聚合酶、核酸模板、引物等分子会组装或固定在多孔材料的孔道中或多孔材料颗粒的间隙里，一方面聚合酶分子就会被多孔材料的孔道或间隙所固定，酶分子的空间结构(三维结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸等温扩增反应试剂的保存方法，其特征在于，是在一种或几种核酸等温扩增反应液的组分中添加多孔材料进行保存。2.如权利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增反应液的组分为核酸等温扩增的聚合酶。3.如权利要求2所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和/或三磷酸核苷酸(NTP)、核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液的任一种或几种。4.如权利要求2或3所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶为 DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。5.如权利要求3所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液为核酸序列依赖性扩增的反应缓冲液、链替代扩增反应缓冲液或环介导等温扩增反应缓冲液。6.如权利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的多孔材料在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为O. 005°/Γ60%。7.如权利要求I或6所述的保存方法，其特征在于所述的多孔材料为孔径不小于I纳米的多孔材料。8.如权利要求7所述的保存方法，其特征在于所述的多孔材料为有序多孔材料和/或无序多孔材料。9.如权利要求8所述的保存方法，其特征在于所述的有序多孔材料为微孔材料、介孔材料、大孔材料中的任一种或几种。10.如权利要求8或...

【专利技术属性】
技术研发人员：张庆利，黄倢，李美霞，宋晓玲，王秀华，刘莉，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：