本发明专利技术公开了贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus?velezensis)菌株ZJ20，该菌株已于2012年4月13日保藏在中国北京市朝阳区中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?NO.5995，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus?velezensis)。)本发明专利技术筛选的生防菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus?velezensis)ZJ20新菌株，具有抗逆性强的芽孢，商品贮藏寿命长，对环境适宜性强，可生产成商品生物制剂；代谢产物杀菌力强，在植株上定殖能力强、速度快，能有效占领杂交竹体表，预防梢枯病的发生。产生的抗菌蛋白(几丁质结合蛋白质)不仅可杀灭病菌，且能促进杂交竹和多种竹类枝叶生长、有恢复病后生产能力的新功效。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) —新菌株ZJ20及其液体制剂。
技术介绍
撑X绿杂交竹是中国南西南等地引种发展的主要经济竹种之一，在经济、生态、社会效益等方面起着巨大作用。而近年来，由半知菌亚门丝孢纲节菱孢属的暗孢节菱孢菌引起的撑X绿杂交竹梢枯病却成为威胁杂交竹产业的重要病害之一，严重阻碍了撑X绿杂交竹的发展，甚至带来毁灭性的灾害，大大降低了撑X绿杂交竹的应用价值。目前，在林业生产上对该病的防治大多采用化学防治，但由于长时期的施用化学农药不仅会造成病原菌抗药性的增强，也会给人们的身体健康和生态环境带来严重伤害，因此针对该病害有必要探索生物防治等新的防治途径，生物防治是生态学领域的一个应用学科分支，是基于生态平衡的原理，引进有益生物基因或基因产物，达到稳定、有效地防治靶标病(虫)，生物农药(biopesticides)是利用生物活体或者其代谢产物对有害生物进行防治的一类制剂，是生物防治的物质基础和重要手段。
技术实现思路
本专利技术在杂交竹生态系中发现贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) —新菌株ZJ20,不仅能有效控制杂交竹梢枯病，且具有促进其生长恢复的新功能。该菌株于2008年6月2日分离自四川省雅安市雨城区金鸡关杂交竹。该菌株已于2012年4月13日保藏在中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 5995，分类命名为贝莱斯芽抱杆菌(Bacillus velezensis)。贝莱斯芽孢杆菌菌株ZJ20的液体制剂，制备方法如下①一级斜面种子常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种贝莱斯芽孢杆菌ZJ20后在26-28°C下培养24-36小时制成一级种子；②二级液体种子改进的营养肉质培养液经高压灭菌后，按IOOmL液体盛于300mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种贝莱斯芽孢杆菌ZJ20斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28°C，初始pH值6. 5，120r/min振荡培养36h，制成贝莱斯芽孢杆菌ZJ20液体种子;③液体发酵改进的营养肉质培养液经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种ZJ20液体种子，接种量10%，温度26-28°C，初始pH值6. 5，120r/min振荡培养72h，制成ZJ20液体制剂。(I)本专利技术筛选的生防菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZJ20新菌株，具有抗逆性强的芽孢，商品贮藏寿命长，对环境适宜性强，可生产成商品生物制剂；(2)代谢产物杀菌力强，在植株上定殖能力强、速度快，能有效占领杂交竹体表，预、防梢枯病的发生。(3)产生的抗菌蛋白(几丁质结合蛋白质)不仅可杀灭病菌，且能促进杂交竹和多种竹类枝叶生长、有恢复病后生产能力的新功效。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。(I)贝莱斯芽孢杆菌ZJ20液体制剂的发酵与应用①一级斜面种子常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基(牛肉膏7. 0g，蛋白胨10g, NaC15g,琼脂17g，水IOOOmL)，接种贝莱斯芽孢杆菌ZJ20后在26-28°C下培养24-36小时制成一级种子。②二级液体种子改进的营养肉质培养液(牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaC15g，竹叶浸溃液IOOOmL)经高压灭菌后，按IOOmL液体盛于300mL三角瓶比例(通氧控制)装瓶，在无菌状态接种贝莱斯芽孢杆菌ZJ20斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28°C，初始PH值6. 5，120r/min振荡培养36h，制成贝莱斯芽孢杆菌ZJ20液体种子。③液体发酵改进的营养肉质培养液(牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaC15g，竹叶浸溃液IOOOmL)经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例(通氧控制)装瓶，在无菌状态接种ZJ20液体种子，接种量10 % (体积比)，温度26-28 °C，初始pH值6. 5，120r/min振荡培养72h，制成ZJ20液体制剂。平板法测定ZJ20对杂交竹梢枯病菌(Arthriniumphaeospermum)抑菌率达到100%以上。此贝莱斯芽孢杆菌ZJ20液体制剂(活体与代谢物混合剂)用常规喷雾器按600倍(体积比)浓度在发病前喷施于杂交竹体表预防其梢枯病的发生(防效78-99% )，每株100毫升，促进杂交竹枝叶生长(促生效果10-25% )(表I)。④制剂保存瓶装制剂常温保存半年或低温(4度)I年半不影响防治和促生效果。(2)液体制剂有效成份提取与应用①液体制剂有效成份提取上述方法生产的液体制剂经四层纱布过滤，取其滤液，用60%饱和度的硫酸铵沉淀，该沉淀经过透析浓缩后为粗提物(粗蛋白)。将粗提物经过High Q Sepharose Fast Flow 强阴离子交换层析、Sephadex G-75 分子筛层析、SephadexG-50分子筛层析后获得几丁质结合蛋白质纯物质。具体过程如下 A DE52 离子交换柱(20cmX I. 5cm)用 lmol/L NaCl 清洗后，以 0. 05mol/L pH8. 5Tris-HCl平衡。取上述粗蛋白上样后，先用0. 05mol/L pH8. 5Tris_HCl淋洗60min，然后以0. 05mol/L pH8. 5 Tris-HCl和lmol/L的NaCl进行阶式梯度洗脱，流速为lmL/min，收集洗脱蛋白峰，蛋白峰液经0. 05mol/LpH8. 5的Tris-HCl透析、聚乙二醇20 000包埋浓缩。B :以 0. 05mol/L pH8. 5 的 Tris-HCl 平衡层析柱(50cmX I. 5cm, G-75 凝胶)。取经离子交换层析后的抗菌蛋白上样，用0. 05mol/L pH8. 5的Tris-HCl洗脱，流速为0. 5mL/min。收集洗脱蛋白峰。C :以 0. 05mol/L pH8. 5 的 Tris-HCl 平衡层析柱(50cmX I. 5cm, G-50 凝胶)。取经离子交换层析后的抗菌蛋白上样，用0. 05mol/L pH8. 5的Tris-HCl洗脱，流速为0. 5mL/min。收集洗脱蛋白峰(几丁质结合蛋白质纯物质。)。②杂交竹上的防病促生应用将该物质(几丁质结合蛋白质)用常规喷雾器按200倍(体积比)浓度喷施于杂交竹体表可降低其梢枯病的发生水平，恢复病后生产能力，每株100毫升，每年春、夏季各施用一次，防效81-97%，促生效果为11-21% (表I)。③其它竹种上的促生应用上述法提取的ZJ20代谢物(几丁质结合蛋白质)稀释10倍(体积比)用常规喷雾器喷施各类竹种枝叶，每株50毫升，每年春、夏季各施用一次，促生效果分别为慈竹120%、麻竹118%、楠竹117%、苦竹120% (表3)。 ④有效成份保存该物质需低温(4°C )贮藏，贮藏期不超半年为宜。表I Bacillus velezensisZJ20生防和促生功能参数杂交竹本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.贝莱斯芽孢杆菌菌株ZJ20，该菌株已于2012年4月13日保藏在中国北京市朝阳区中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 5995。2.权利要求I所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株ZJ20的液体制剂，其特征在于，制备方法如下①一级斜面种子常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种贝莱斯芽孢杆菌ZJ20后在26-28°C下培养24-36小时制成一级种子； ②二级液体种子改进的营养肉质培养液经高压灭菌后，按IOOmL...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱天辉，李姝江，梁漫，谯天敏，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。