本发明专利技术公开了一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，属于病毒的分子生物学检测技术领域。本发明专利技术的羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒包括SEQIDNO:1~2所示核苷酸序列的一对引物和SEQIDNO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针。本检测试剂盒能快速、准确检测出样品中的羊口疮病毒，且检测灵敏度高，取样简便，检测效率大大提高，并且能够有效防止污染。对进出口动物检验检疫领域中有较大的实际意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中病毒的分子生物学检测方法，具体涉及一种可以对羊口疮病毒进行早期快速诊断的羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒。
技术介绍
羊口疮(Orf),又称为羊传染性脓疱皮炎(contagious ecthyma),是由羊口疮病毒(Orf virus, 0RFV)引起的山羊和绵羊的一种急性接触性传染病，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和结成疣状厚痂为特征。ORFV主要感染山羊和绵羊，也可感染人和其它动物，是一种人畜共患性疾病，世界动物卫生组织规定的法定报告传染病。羊口疮在许多养羊国家分布广泛，在我国北方、西北等养羊较多的地方也较常见，是羊的主要疫病之一。由于病毒的抵抗力强，羊群一旦被感染则不易清除，可持续危害羊群多年，给畜牧业造成较大的经济损失。在羊群中，羊口疮病毒主要感染羔羊和小羊，其病死率比成年羊要 高，国内外近年有不少相关的病例报道。而最近也有包括猫、驯鹿、骆驼、鬣羚等动物感染羊口疮病毒的报道，提示羊口疮病毒的宿主范围有所扩大。ORFV初次感染时皮肤损害经过大约6 8周逐渐恢复，留下结痂，而结痂就成为病毒存储场所，并可能污染周围环境。如果出现继发感染，病羊的死亡率会明显上升。ORFV也能感染人，易感人群为经常接触病羊者，如饲养员、杀羊的屠夫和兽医等。病人通常出现手指，手掌或指关节处的丘疹，有时也会在脸部、嘴唇等其他部位发病。除局部损害外，偶尔也会有发热、乏力、淋巴结肿大等症状。病毒在人与人之间的传播目前还没有报道，但也不能完全排除其可能性。通常，皮肤损害经过Γ12周左右逐渐减弱，最后在病变区留下疤痕。一般情况，病人症状都不太严重，并且疾病有很好的自限性。但也有个别免疫功能不全的病例会发生严重的损害。由于ORFV在世界范围内分布广泛，具有典型的动物传染性，因此成为动物痘病毒里仅次于牛痘病毒的研究最为广泛的病毒。ORFV为双链DNA病毒,属于痘病毒科,脊椎动物痘病毒亚科,副痘病毒属。这个属的其他成员还包括小牛侵蚀性口炎病毒(bovine papularstomatitis virus, BPSV)和伪牛痘病毒(pseudocowpox virus, PCPV)等。ORFV 的基因组全长约140kb，编码133个蛋白，大约80%左右的基因位于基因组中心位置相对保守，与其它痘病毒基因高度同源。病毒粒子呈砖形或椭圆形，其表面呈绳索样纵横交错排列结构，颗粒外面有一层膜，该病毒可在牛、绵羊、山羊的肾细胞以及犊牛和羔羊的睾丸细胞内生长，并产生细胞病变。对于受ORFV感染的动物，目前还没有特效的治疗药物。常用的处理措施是对损伤部位的局部清洗，并使用抗生素控制继发感染。在国内，会使用有去腐生肌、消炎止痛作用的中药辅助治疗羊口疮。而在国外，化疗药物也被用于治疗感染ORFV的人及动物。其中，西多福韦对多种痘病毒具有很强的对抗作用。它能减轻病羊的损伤程度和皮肤损伤持续时间，减少存在于皮肤损伤部位的病毒数量。最近有报道使用西多福韦/硫糖铝混合胶体喷洒药剂治疗感染ORFV的羊羔，但都不能彻底消除ORFV的重复感染现象，并且目前还没有很好的ORFV疫苗能够提供长时间有效的保护。羊口疮目前还没有国际通用的诊断标准，主要根据典型的临床症状并结合实验室检查来诊断。诊断时需要与口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)和羊痘(Capripox)区分开来，有时还要与蓝舌病和细菌性疾病进行鉴别。由于缺乏有效的疫苗，症状上鉴别非常困难，因此，对于ORFV的感染防控形势还十分严峻，急需开发一种早期快速诊断羊口疮病毒感染的试剂盒。目前所采用的实验室诊断，常用的包括PCR、ELISA、电镜，其他的还有组织病理学、免疫荧光、Western blotting、限制性片段长度多态性(RFLP)分析等等。但这些方法存在着一定的不足之处，这些建立起来的方法，相当一部分是针对细胞培养病毒液，很少直接将方法应用于病毒载量较低的临床样本检测，检测灵敏度较低，容易出现假阳性结果。病毒培养并进行病毒的全基因组序列测定，虽可以确定羊口疮病毒感染，但无法为临床诊断及时提供结果，且灵敏度较低。因此卫生部印发的《人感染猪流感预防控制技术指南(试行)》中推荐用实时荧光(Real-time) PCR方法进行检测，由于其方法学上具有简便快速、灵敏度和特异性高的特点，可以实现早期快速诊断。但目前国内外均尚未开发出检测羊口疮病毒实 时荧光PCR试剂盒，因此开发该试剂盒成为当务之急。实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。探针法实时荧光定量PCR技术是实时荧光PCR技术的一种，是一种直接快速检测DNA的方法，在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。与传统的PCR相比较，实时荧光PCR技术具有如下优点I、通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃普通PCR方法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对检测样品进行准确定量分析，从而有效监测药物治疗的效果；2、具有更高的灵敏度，更低的检测限，对病毒的感染可以实现早期检测；4、由于采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；5、由于在普通PCR基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，进一步提高了检测靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在DNA样品的检测和分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。我国食品与药品管理局(SFDA)已经批准了病原体的实时荧光PCR检测试剂盒的生产与临床应用。因此，通过实时荧光PCR方法开发一种检测ORFV的试剂盒在技术上是可行的，它的应用将极大满足ORFV快速检测与监测工作的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括SEQ ID NO: f 2所示核苷酸序列的一对引物和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针，TaqMan探针的5’端标记有荧光报告基因，3’端标记有淬灭荧光基团。众所周知，在使用已知的实时荧光PCR技术检测和定量分析样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计、筛选及制备适当的引物和寡核苷酸探针。本专利技术的引物和探针是根据羊口疮病毒0RFV024基因的保守区域[ORFV NZ2病毒株基因组(GenBank accession No. DQ184476. I) 23758bp-23844bp本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于包括SEQ ID N0:f2所示核苷酸序列的一对引物和SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列的TaqMan探针，TaqMan探针的5’端标记有突光报告基因,3’端标记有淬灭突光基团。2.根据权利要求I所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述TaqMan探针的5’端标记的荧光报告基因为FAM，3’端标记的淬灭荧光基团为Tamara。3.根据权利要求I所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒中还包括PCR反应缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、阳性质控品和阴性质控品。4.根据权利要求3所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒组成为 TaqMan探针引物混合液I管浓度为5 μ M的TaqMan探针、浓度为10 μ M的SEQ IDΝΟ:1所示引物和浓度为ΙΟμΜ的SEQ ID NO: 2所示引物按体积比为I: I: I组成的混合液； TaqMan Mix I管10XPCR反应缓冲液、25mM的dNTP和IOU的DNA聚合酶以及酶稀释液按体积比为25:4:5:1组成的混合液； 阳性质控品I管浓度为O. 5ng/ μ L的羊口疮病毒0RFV024基因片段样品； 阴性质控品I管0. OlM PBS ; 无菌水I管。5.根据权利要求3所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒实时荧光定量PCR反应体系为25 μ L，其中5 μ M的TaqMan探针I μ L，10 μ M的上、下游引物各lyL，样品 DNA I μ L，10XPCR 反应缓冲液 2. 5 μ L，25mM 的 dNTP O. 4 μ L...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜红延，罗树红，郝文波，李明，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：
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