本发明专利技术涉及一株固氮红细菌（Rhodobacter?azotoformans）Y6及其培养方法与应用，该菌株具有产类胡萝卜素C-3,4脱氢酶，可以催化链孢红素和番茄红素进行C-3,4脱氢反应，生成3,4-二脱氢链孢红素和3,4-二脱氢番茄红素的功能。此外本发明专利技术还提供该固氮红细菌的菌株、特征、培养方法及其类胡萝卜素C-3,4脱氢酶的催化性质。来源于该菌株的crtD基因在大肠杆菌中重组表达的重组酶能催化链孢红素或番茄红素脱氢分别生成3,4-二脱氢链孢红素或3,4-二脱氢番茄红素，为3,4-二脱氢链孢红素和3,4-二脱氢番茄红素的微生物发酵生产提供了新的酶源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株产生催化链孢红素和番茄红素脱氢的类胡萝卜素C-3，4脱氢酶的固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans) Y6及其培养方法与应用，属于微生物
技术介绍
类胡萝卜素是ー种多类异戊ニ烯化合物，广泛存在于微生物、植物、动物体内。类胡萝卜素包含特殊的长链多烯共轭结构，使其具有了特殊的生理活性，包括光吸收、抗氧化、淬灭自由基等。目前类胡萝卜素生产主要靠植物提取，产量有限，不能满足需求，微生物发酵生产成为研究热点。通过在工程菌株中表达不同的类胡萝卜素合成酶可以产生不同种类的类胡萝卜素，寻求新的微生物来源可以获得不同催化特征的类胡萝卜素合成酶，为不同种类类胡萝卜素的生产提供新途径。类胡萝卜素C-3，4脱氢酶(CrtD)是类胡萝卜素合成途径中的ー个脱氢酶，通常催化I-羟基类胡萝卜素和I’ -羟基类胡萝卜素进行C-3，4和C-3’，4’脱氢反应。在产氧光合细菌——蓝细菌中，有文献报道CrtD催化链孢红素和番茄红素进行C-3，4脱氢的反应，但在不产氧光合细菌中尚未发现CrtD具备该催化特性。经检索，目前国际上没有固氮红细菌产类胡萝卜素C-3，4脱氢酶的文献报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有微生物类胡萝卜素合成酶种类有限，特别是不产氧光合细菌类胡萝卜素C-3，4脱氢酶催化链孢红素和番茄红素脱氢研究的空白，提供一株产生催化链孢红素和番茄红素脱氢的类胡萝卜素C-3，4脱氢酶的固氮红细菌(Rhodobacterazotoformans) Y6及其培养方法与应用。专利技术概述本专利技术所述的固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans) Y6,具有产类胡萝卜素C-3，4脱氢酶，可以催化链孢红素和番茄红素进行C-3，4脱氢反应，生成3，4-ニ脱氢链孢红素和3，4-ニ脱氢番茄红素的功能。此外本专利技术还提供该固氮红细菌菌株的特征、培养方法与应用。专利技术详述一株固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans) Y6菌株,2012年5月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 6086。上述固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans) Y6的培养方法,步骤如下将固氮红细菌(Rhodobacterazotoformans) Y6 按 8 12wt% 接种量接种于 RCVBN培养基中，在温度为25 35°C的条件下恒温光照静置培养48 72小吋，即可； 上述RCVBN培养基组分如下MgSO4 · 7H20 0. 2g/L, CaCl2 0. 056g/L, FeSO4 · 7H20 0. 012g/L, Na2EDTA 0. 02g/L, H3B032. 8X l(T3g/L，MnSO4L 6X l(T3g/L，ZnSO4 · 7H20 2. 4X l(T4g/L，Na2MoO4 · 2H207. 52 X l(T4g/L，Ca (N03) 2 · 3H20 4 X l(T5g/L，生物素 I. 5 X l(T5g/L，尼克酸 I X l(T3g/L，对氨基苯甲酸 I X 10-3g/L，盐酸硫胺素 I X 10-3g/L，KH2PO4 O. 6g/L，K2HPO4 · 3H20 0. 9g/L，DL-苹果酸 4g/L，(NH4)2. SO4 lg/L，pH6.8，115°C灭菌 30 分钟。根据本专利技术优选的，所述培养温度为30°C。本专利技术固氮红细菌Y6菌株产生的CrtD能催化链孢红素和番茄红素进行脱氢反应。上述固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans) Y6在链孢红素或番爺红素脱氢反应中的应用。上述应用，步骤如下 利用PCR技术以固氣红细菌(Rhodobacter azotoformans)Y6菌株基因组DNA为模板，采用上游引物 D-F :TGCCATATGATGAGACAGATTGTGCCGAA (SEQ ID NO. 3)和下游引物 D-R :TCGAAGCTTCCTCGATCGCGAAGCAAGGT (SEQ ID NO. 4)，扩增类胡萝卜素 crtD 基因，将该基因通过表达载体pET-22b在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达，收集重组大肠杆菌细胞超声波破壁制备重组CrtD粗酶液，再利用重组CrtD粗酶液对链孢红素或番茄红素进行体外脱氢反应，生成3，4- ニ脱氢链孢红素或3，4- ニ脱氢番茄红素。以上操作步骤、实验条件及试剂如无特别说明，均采用本领域常规操作和常用试齐 。有益效果本专利技术所述固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans) Y6中，含有类胡萝卜素C-3, 4-脱氢酶，该酶能催化链孢红素或番茄红素进行脱氢反应分别生成3，4- ニ脱氢链孢红素或3，4-ニ脱氢番茄红素，该特征在不产氧光合细菌中为首次发现，为3，4-ニ脱氢链孢红素或3，4- ニ脱氢番茄红素的微生物发酵生产提供了新的酶源。附图说明图I是固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans)Y6重组CrtD粗酶液催化链孢红素脱氢产物HPLC图；其中，1、3，4- ニ脱氢链孢红素；2、链孢红素；图2是固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans)Y6重组CrtD粗酶液催化番爺红素脱氢产物HPLC图；其中，3、3，4-ニ脱氢番茄红素；4、番茄红素；图3是固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans)Y6重组CrtD粗酶液催化链抱红素脱氢产物3，4- ニ脱氢链孢红素光吸收图谱；图4是固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans)Y6重组CrtD粗酶液催化番爺红素脱氢产物3，4- ニ脱氢番茄红素光吸收图谱；图5是固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans)Y6重组CrtD粗酶液催化链抱红素脱氢产物3，4- ニ脱氢链孢红素质谱图谱；图6是固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans)Y6重组CrtD粗酶液催化番爺红素脱氢产物3，4- ニ脱氢番茄红素质谱图谱。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术做进ー步阐述，但本专利技术所保护范围不仅限于此。实施例中所述固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans)Y6, 2012年5月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No. 6086。Na2EDTA购自美国Amresco公司；Na2Mo04 · 2H20购自上海胶体化工厂；对氨基苯甲酸购自上海化学试剂采购供应站；DL-苹果酸购自天津市大茂化学试剂厂；生物素、尼克酸、盐酸硫胺素购自中国医药(集団)上海化学试剂公司；蛋白胨和酵母粉购自英国Oxoid公司。高效液相色谱仪及色谱柱TC-C18均购自美国Agilent公司。实施例I :一株固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans),于山东省济南市小清河生活污水中分离获得，具有如下生物学特征(I)形态学特征观察革兰氏染色阴性，细胞椭圆形，菌体直径为O. 6 μ πΓ . 2 μ m ;在光照厌氧、黑暗好氧和黑暗厌本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一株固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans) Y6菌株,2012年5月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 6086。2.权利要求I所述固氮红细菌(Rhodobacterazotoformans) Y6的培养方法,其特征在于，步骤如下 将固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans) Y6按8 12wt%接种量接种于RCVBN培养基中，在温度为25 35°C的条件下恒温光照静置培养48 72小吋，即可； 上述RCVBN培养基组分如下MgSO4 · 7H20 O. 2g/L, CaCl2 O. 056g/L, FeSO4 · 7H20 0. 012g/L, Na2EDTA 0. 02g/L, H3B032. 8X l(T3g/L，MnSO4 I. 6X l(T3g/L，ZnSO4 · 7H20 2. 4X l(T4g/L，Na2MoO4 · 2H20.7.52 X l(T4g/L，Ca (N03) 2 · 3H20 4 X l(T5g/L，生物素 I. 5 X l(T5g/L，尼克酸 I X l...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖敏，张金华，卢丽丽，钱新民，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
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