用于在视黄酸存在下制备T细胞群的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于制备包含记忆样T细胞的细胞群的方法，所述方法的特征在于，包括使用视黄酸和CD3配体体外培养包含T细胞或T细胞前体细胞的细胞群的步骤。本发明专利技术还公开了一种用于制备其中记忆样T细胞比例增加和其中所需基因被高效导入并高度表达的细胞群的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及ー种用于制备包含记忆T-样细胞的细胞群的方法，其可用于医学领域，尤其是免疫治疗。本专利技术还涉及ー种用于制备包含被所需基因高效转移到其中的T细胞的细胞群的方法，其可用于医学领域。本申请要求2009年8月25日申请的日本专利申请号2009-194444和2009年12月18日申请的日本专利申请号2009-287258的优先权，两篇申请都以其整体结合到本文中。
技术介绍
保护活体免受外源物质主要通过免疫应答，免疫系统由各种细胞和它们产生的可溶性因子组成。在各种细胞中，白细胞，尤其是淋巴细胞起主要作用。淋巴细胞分为称为B淋巴细胞(在下文中，在某些情况下称为B细胞)和T淋巴细胞(在下文中，在某些情况下称为T细胞)的两种主要类型，且两种细胞都特异性识别抗原并作用于抗原以保卫活体。在外周中，具有⑶(分化群)4标记物的⑶4阳性T细胞和具有⑶8标记物的⑶8阳性T细胞占T细胞的大多数。大多数CD4阳性T细胞(称为辅助T (在下文中称为Th)细胞)參与辅助抗体产生和诱导各种免疫应答，并视通过抗原刺激从其产生的不同种类的细胞因子，分化为Thl型、Th2型等。大多数⑶8阳性T细胞(称为细胞毒性T细胞[Tc 细胞毒性T淋巴细胞，亦称为杀伤性T细胞，在下文中，在某些情况下称为CTL])通过抗原刺激表现细胞毒活性，并分化为产生I型细胞因子(例如干扰素-Y (IFN-y)和白细胞介素-2(IL-2))的Tcl型或产生II型细胞因子(例如IL-4和IL-10)的Tc2型。ー些CTL可识别其中主要组织相容性复合体(在下文中，缩写为MHC)中编码的MHC I类分子(在人的情况中，称为人白细胞抗原I类分子，在下文中缩写为HLA I类分子)通过特定T细胞受体(在下文中缩写为TCR)与抗原结合到一起的复合体，并破坏在细胞表面上呈递复合体的细胞。作为仅次于外科手术、化学疗法和放射疗法的第四种癌症疗法，免疫治疗最近已引起关注。因为免疫治疗利用人本来拥有的免疫能力，所以据说对患者的身体劳损相比于其他治疗要轻。已知的免疫治疗包括包括细胞(例如淋巴因子激活的细胞、NKT细胞或YST细胞)转移的治疗，所述细胞通过使用各种方法扩大培养从离体诱导CTL或者外周血淋巴细胞获得；树突细胞转移治疗和肽疫苗治疗，预期通过所述治疗体内诱导抗原特异性CTL ；Thl细胞治疗；和免疫基因治疗，其包括将可预期各种效果的基因离体转移到这些细胞中，并将细胞转移到体内。淋巴因子激活的细胞(LAK细胞)是具有细胞毒活性的功能细胞群,其通过向包含淋巴细胞的外周血(外周血白细胞)、脐带血、组织液等中加入IL-2，随后体外培养数天获得。通过向培养物中加入抗-CD3抗体，进ー步加快LAK细胞的増殖。如此获得的LAK细胞对多种癌细胞和其他靶标非特异性地具有毒活性。对于包括转移LAK细胞的免疫治疗，存在的问题是例如离体诱导的抗原特异性CTL的扩大培养期间如何維持细胞毒活性，和可如何有效地离体扩大培养淋巴细胞。为了解决这样的问题，已研究了使用纤连蛋白或其片段的作用(例如，专利文献1-3)。通过分析其细胞表面抗原，将记忆T细胞与幼稚T细胞区分开。亦可通过其功能的不同将记忆T细胞与幼稚T细胞区分开。換言之，相比于幼稚T细胞，记忆T细胞可通过较弱的抗原刺激更加迅速地分化为效应细胞(非专利文献I)。另外，记忆T细胞与幼稚T细胞功能上不同，因为从记忆T细胞分化而来的一种效应细胞可同时产生多种细胞因子。然而，记忆T细胞分化的分子机制是未知的。基于归巢能力或效应子功能的不同，记忆T细胞包括称为中枢记忆T细胞和效应记忆T细胞的两种不同细胞群(非专利文献2)。近年来，已报道，在免疫治疗中可通过向活体给予与已终末分化的效应T细胞相 比处于较未分化状态的幼稚T细胞或中枢记忆T细胞预期高得多的治疗效果(例如非专利文献3和4)。就免疫基因治疗而言，可预期赋予对靶抗原特异的细胞毒活性，例如通过将能够识别靶抗原的TCR基因转移到T细胞(包括CTL)中。基于该预期，已尝试了使用靶向各种抗原(例如MARTI、gplOO和mHAG HA-2抗原)的TCR基因的基因治疗。另外，已尝试了使用编码作为被转移到T细胞中的受体的嵌合受体的基因的基因治疗，该嵌合受体通过组合人源TCR和源自非人生物的TCR，以及识别靶抗原的抗体的抗原识别位点、与TCR缔合形成抗原识别复合物的ー类分子(例如CD3)、T细胞表面抗原(例如CD8、CD28)及其一部分而获得。各种载体用于基因转移。许多为临床应用于人而被研究的基因治疗使用重组反转录病毒载体(例如复制能力缺陷的反转录病毒载体)。因为反转录病毒载体将所需外源基因有效转移到细胞中并将该基因稳定整合到染色体DNA中，所以尤其对于基因表达在长时间内是所需的基因治疗，反转录病毒载体是优选的基因转移手段。纤连蛋白是存在于动物血液中、细胞表面上和组织细胞外基质中的具有250，000分子量的巨大糖蛋白，并已知具有多种功能。使用功能物质(例如纤连蛋白或其片段)的基因转移方法使得能够进行高效的基因转移，而不需要共培养反转录病毒产生细胞和靶细胞(例如专利文献4)。据相信，通过上述方法改进基因转移效率是由于下述事实存在功能物质使得能将反转录病毒和靶细胞放置于使它们相邻的状态，藉此増加它们相互作用的机会。在这种使用反转录病毒的基因转移中，用反转录病毒感染靶细胞导致基因的转移。然而，用反转录病毒的基因转移效率从实际临床应用的角度来看尚不能令人满意，仍强烈期望进ー步改善感染效率。已报道，视黄酸(维生素A代谢物)是ー种将对小肠组织的归巢特异性印迹到T细胞上的生理因子(专利文献5)。然而，没有教导或暗示通过在视黄酸存在下培养T细胞 改善转移到培养的细胞中的基因转移效率。现有技术參考文献专利文献[专利文献1]TO03/016511[专利文献2]TO03/080817[专利文献3]冊2005/019450[专利文献4]W000/01836[专利文献5]JP-A2005_336062非专利文献[非专利文献I]Nat. Tmmun01.,第 I 卷,第 47-53 页，2000[非专利文献2]Nature，第 401 卷，第 708-712 页，1999[非专利文献3] J. Clin. Invest.，第 115 卷，第 6 期，第 1616-1626 页，2005[非专利文献4] J. Immunol.，第 175 卷，第 2 期，第 739-748 页，2005 专利技术的公开专利技术所要解决的问题本专利技术的ー个目的是提供ー种用于制备包含在视黄酸存在下的培养物且适合于医学用途(例如癌症免疫治疗)的包含高比例的记忆T-样细胞的细胞群的方法，和提供在给予活体时是有效的通过该方法获得的细胞群。用于解决问题的方法本专利技术人深入地进行了努力以解决上述问题。结果他们发现，通过使用视黄酸和CD3配体离体培养包含T细胞或T细胞前体细胞的细胞群，可获得其中不仅所需基因被高效转移并高度表达，而且具有高含量记忆T-样细胞的细胞群。因此完成本专利技术。下文给出本专利技术的概述。本专利技术的第一方面涉及ー种用于制备包含记忆T-样细胞的细胞群的方法，其包括使用视黄酸和CD3配体离体培养包含T细胞或T细胞前体细胞的细胞群的步骤。本专利技术用于制备包含记忆T-样细胞的细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.08.25 JP 2009-194444;2009.12.18 JP 2009-287251.ー种用于制备包含记忆T-样细胞的细胞群的方法，其包括使用视黄酸和⑶3配体离体培养包含T细胞或T细胞前体细胞的细胞群的步骤。2.权利要求I的方法，其中离体培养包含T细胞或T细胞前体细胞的细胞群的步骤为选自(1)-(3)的任何步骤 (1)在视黄酸和CD3配体存在下培养包含T细胞或T细胞前体细胞的细胞群的步骤， (2)在视黄酸和CD3配体存在下培养包含 T细胞或T细胞前体细胞的细胞群，然后在视黄酸和CD3配体不存在下培养细胞群的步骤，和 (3)在CD3配体存在和视黄酸不存在下培养包含T细胞或T细胞前体细胞的细胞群，然后在视黄酸存在下培养细胞群的步骤。3.权利要求I或2的方法，其中在纤连蛋白或其片段或者它们的混合物存在下进行离体培养包含T细胞或T细胞前体细胞的细胞群的步骤。4.权利要求1-3中任ー项的方法，其中包含T细胞或T细胞前体细胞的细胞群为外周血单核细胞。5.权利要求1-4中任ー项的方法，还包括从所产生的细胞群中选择性回收记忆T-样细胞的步骤。6.—种细胞群,其通过权利要求1-5中任ー项的方法制备。7.ー种用于制备被所需基因转移到其中的细胞群的方法，其包括以下步骤 (a)通过权利要求I...

【专利技术属性】
技术研发人员：片山敬章，酒井研辅，吉冈广文，高藏晃，蝶野英人，齐藤尚纪，峰野纯一，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：