一种防治蔬菜真菌病害微生物农药的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种防治蔬菜真菌病害微生物农药的制备方法，属于微生物技术领域。该方法利用一种从枸骨组织内分离，筛选出的内生真菌－哈茨木霉菌株Ｌ，经过菌种的活化培养；种子液培养；发酵培养；发酵物提取；将所提纯倍半萜类化合物配以农用药物辅料等步骤，制备成多种剂型的农用药物。该微生物农药可用于防治西瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、黄瓜立枯病、菜豆炭疽病和番茄早疫病等蔬菜真菌病害，其防治效果较常规化学药剂略优，且安全，可在蔬菜生产地区推广应用。

Method for preparing microbial pesticide for preventing and controlling vegetable fungus disease

The invention discloses a preparation method of a microbial pesticide for preventing and controlling vegetable fungal diseases. A separation from Chinese holly tissue by the method of screening the endophytic fungi, Trichoderma harzianum strain L, activated by culturing bacteria; seed liquid culture; fermentation; fermentation extract; the purified sesquiterpenes with agricultural adjuvant steps, preparation of agricultural medicine in various forms. The microbial pesticide is used to control fungal diseases of Watermelon Fusarium wilt, Fusarium Wilt of cucumber blight, anthracnose, cucumber and Tomato Early Blight and its control effect is better than other normal chemical agents, and safe, can be widely used in vegetable production area.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物
，特别是涉及植物内生真菌防治部分蔬菜真菌病害有效菌株的分离，及其抑菌代谢产物的制备与应用方法。
技术介绍
植物体内都存在大量的内生真菌，内生真菌最早发现于牧草，后来又在木本植物、草本植物、禾本植物、苔藓、地衣、海藻等植物中被发现。迄今的研究表明，植物内生真菌可增强宿主的抗病性、提高植物的生产力、抗逆抗虫等。发挥这些作用是由于内生真菌在植物体内繁殖和生长，并在体内产生有生物活性的次生代谢产物。因此，内生真菌可能成为生物防治中有潜力的生物控制剂，在生态农业和生物农药研制方面具有重要的用途。近年来植物内生真菌已引起了微生物学家、生态学家、植物保护学家的广泛兴趣，逐渐成为国内外研究的热点。目前微生物源生物化学农药的研究和开发在我国十分活跃，但微生物资源及其应用潜力尚没有得到充分的发挥，而植物内生真菌即是这样一类有待开发的新兴微生物资源。 枸骨(Ilex cornuta Lindl.et Paxt.)为冬青科常绿植物，主要分布于河南、湖北、湖南、安徽、江苏、浙江、江西、福建等地。枸骨叶味苦、微涩，性寒，是一种中药，始载于《本草拾遗》。传统中医药理论认为，枸骨叶具有清热养阴，平肝益肾，散风通络等功效；近代药理研究表明，枸骨叶具有抗生育，扩张冠状动脉，抗菌等作用。众所周知，雷公藤具有多种医药作用，从雷公藤中提取的化学成分具有抗肿瘤、抗炎、免疫抑制及抗生育作用，还有治疗类风湿性关节炎等作用。同样雷公藤也是一种良好的杀虫植物，具有胃毒、拒食、抑制生长发育等杀虫活性。D.Siva Sundara Kumar等从雷公藤中筛选到代谢产物具有抗类风湿作用的内生真菌(Journal of Ethnopharmacology，2004，295-300)，申屠旭萍等从雷公藤中筛选到具有对农作物真菌病害具有抑制作用的内生真菌(雷公藤内生真菌的分离及活性菌株的筛选，浙江农业学报，2006，18(5)308-312)。枸骨作为一种医药植物，已引起研究者广泛兴趣，但它是否也和雷公藤药用植物一样能在防治农作物病虫害中发挥作用，关于这方面的研究还未曾涉足，国内外未见有报道。为了能充分利用天然植物枸骨，发挥其对人类的最大作用，本专利技术对采自临安天目山的活体枸骨组织进行内生真菌的分离研究，并将所分离到的内生真菌对部分常见蔬菜真菌病害病原菌拮抗活性进行了检测研究，该专利技术不仅为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株同时也为利用枸骨内生真菌的天然活性物质开发农用抗生素提供理论依据和生产参数。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的不足，提供一种从枸骨组织内分离筛选出的内生真菌-哈茨木霉菌株L；本专利技术的另一目的是提供利用该菌株L通过发酵提取其代谢产物制备成防治部分蔬菜真菌病害的微生物农药及其制备方法。 本专利技术枸骨内生真菌-哈茨木霉菌株L的分离、筛选与鉴定是于2006年5月在浙江临安天目山采集的枸骨茎中，经表面消毒、内生真菌的分离、培养和发酵、活性测定以及对抑制蔬菜真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤获得并保存；经微生物分类学鉴定为哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum Rifai)，定名为哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登记号CGMCC No.1780。 枸骨内生真菌-哈茨木霉菌株L，其固体培养特征为菌落在PSA平板上25℃3-4天扩展9cm，初期白色稀疏，菌丝沿培养基表面匍匐生长，后形成黄绿色产孢区。反面无色。菌丝具隔，分枝。 其形态特征为分生孢子梗形成金字塔式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4.5-10×2.5-3.5μm；分生孢子球形、近球形，单个近无色，聚集时呈淡灰绿色，壁光滑，直径2.5-3.0μm；厚垣孢子球形、近球形，无色，光滑，直径5.5-7.0μm。 本专利技术所述的哈茨木霉菌株L，经发酵提取可获得对部分蔬菜真菌病害病原菌具有抑制作用的活性成分倍半萜类化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)。 本专利技术目的通过以下技术方案来实现一种防治西瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、黄瓜立枯病、菜豆炭疽病和番茄早疫病等蔬菜真菌病害微生物农药的制备方法，按以下步骤进行(1)菌种的活化培养将分离保存的枸骨内生真菌-哈茨木霉菌株L菌种移至试管内马铃薯葡萄糖培养基(PDA)斜面上，在28℃±1℃条件下，菌种活化培养96h，至试管斜面长满绿色孢子；(2)种子液培养挑取少量活化培养孢子转接至马铃薯葡萄糖液体培养基，pH自然，每300mL三角瓶装发酵培养液40mL，种子摇床培养温度28℃±1℃，培养时间36h；(3)发酵培养发酵培养液为每1000mL中含有葡萄糖10g，蔗糖15g，牛肉膏10g，蛋白胨5g，MnCl215mg，CaCO32g，每300mL三角瓶装发酵培养液40mL；配制后121℃灭菌20min，待冷却至40℃在无菌条件下按体积百分含量5％～10％的接种量接种，在28℃±2℃条件下，培养4天；(4)发酵物提取发酵完毕，收集发酵液，按常规化学方法提取、层析，分离纯化获得倍半萜类化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)，该化合物分子式为C17H24O4，结构式见下图； (5)将纯倍半萜类化合物配以农用药物辅料，制备成多种剂型的农用药物。 本专利技术的有益效果一是本专利技术从枸骨中分离筛选出代谢物产量高、并对部分蔬菜真菌病害病原菌具有较强抑制作用的内生真菌菌株-哈茨木霉菌株L，该菌株L与以往关于哈茨木霉的众多报道存在有以下的不同之处，这为农业上防治蔬菜真菌病害病原菌提供了一种微生物新菌株；其一，在菌株形态等特征上有明显的不同如专利技术专利申请《一种哈茨木霉真菌菌株》(公开号CN 1554742A)中哈茨木霉菌落在PSA培养基上形态为羊绒状，菌落老熟时暗绿色，形成明显的突起直达培养皿顶部；分生孢子梗呈树状分枝。而本专利技术哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L在同样的培养基上培养后菌落不形成突起，产孢区为黄绿色，分生孢子单个近无色，聚集时呈淡灰绿色，分生孢子梗形成金字塔式的分枝轮廓。迟玉杰等(对哈茨木霉转化子菌体形态观察及抗药性测定.哈尔滨工业大学学报，2002，34(6)784-788)报道的哈茨木霉菌株，孢子颜色为深绿色，平板反正面同色，菌落形态为棉絮状；而本专利技术哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L菌落正面形成黄绿色产孢区，反面无色，正反面颜色完全不同。 其二，在利用哈茨木霉作为生防菌剂的抑制机理与利用方式有所不同以往研究大多是利用哈茨木霉菌株产生几丁质酶，通过几丁质酶降解真菌细胞壁的主要成分几丁质从而达到杀菌的目的。也有的报道是直接利用哈茨木霉孢子并开发成哈茨木霉孢子制剂防治蔬菜真菌病害，目前生产上常用的木霉菌剂多为活分生孢子制剂，已有许多商品化的木霉制剂问世，如以色列开发的哈茨木霉T39可湿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种防治西瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、黄瓜立枯病、菜豆炭疽病和番茄早疫病蔬菜真菌病害微生物农药的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：（１）菌种的活化培养：将分离保存的枸骨内生真菌－哈茨木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ Ｒｉｆａｉ）菌株Ｌ，ＣＧＭＣＣＮｏ．１７８０的菌种移至试管内马铃薯葡萄糖培养基（ＰＤＡ）斜面上，在２８℃±１℃条件下，菌种活化培养９６ｈ，至试管斜面长满绿色孢子；（２）种子液培养：挑取少量活化培养孢子转接至马铃薯葡萄糖液体培养基 ，ｐＨ自然，每３００ｍＬ三角瓶装发酵培养液４０ｍＬ，种子摇床培养温度２８℃±１℃，培养时间３６ｈ；（３）发酵培养：发酵培养液为每１０００ｍＬ中含有葡萄糖１０ｇ，蔗糖１５ｇ，牛肉膏１０ｇ，蛋白胨５ｇ，ＭｎＣｌ↓［２］１５ｍｇ，ＣａＣＯ ↓［３］２ｇ，每３００ｍＬ三角瓶装发酵培养液４０ｍＬ；配制后１２１℃灭菌２０ｍｉｎ，待冷却至４０℃在无菌条件下按体积百分含量５％～１０％的接种量接种，在２８℃±２℃条件下，培养４天；（４）发酵物提取：发酵完毕，收集发酵液，按常规化学 方法提取、层析，分离纯化获得倍半萜类化合物Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃ－９－ｅｎ－４－ｏｌ，１２，１３－ｅｐｏｘｙ－，ａｃｅｔａｔｅ，（４β）－（８ＣＩ，９ＣＩ）；（５）将纯倍半萜类化合物配以农用药物辅料，制备成多种剂型的农用药物。...

【技术特征摘要】
1.一种防治西瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、黄瓜立枯病、菜豆炭疽病和番茄早疫病蔬菜真菌病害微生物农药的制备方法，其特征在于按以下步骤进行(1)菌种的活化培养将分离保存的枸骨内生真菌-哈茨木霉(Trichodermaharzianum Rifai)菌株L，CGMCC No.1780的菌种移至试管内马铃薯葡萄糖培养基(PDA)斜面上，在28℃±1℃条件下，菌种活化培养96h，至试管斜面长满绿色孢子；(2)种子液培养挑取少量活化培养孢子转接至马铃薯葡萄糖液体培养基，pH自然，每300mL三角瓶装发酵培养液40mL，种子摇床培养温度28℃±1℃，培养时间36h；(3)发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：申屠旭萍，俞晓平，
申请(专利权)人：中国计量学院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]