一种黑平菇提取物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种黑平菇提取物及其制备方法与应用。该方法：（１）是将黑平菇菌丝粉与ｐＨ值为６－９的磷酸缓冲液混合，在２－６℃浸提，离心取上清液得到黑平菇提取物溶液；（２）上清液加入硫酸铵至饱和度为４０％，在２－６℃放置８－１６小时后离心；（３）上清液加入硫酸铵至饱和度为７０％，在０－４℃放置８－１６小时后离心。（４）用蒸馏水溶解沉淀得到黑平菇抗ＴＭＶ的蛋白。本发明专利技术的黑平菇提纯物属于天然提取物，对人类和环境均无害。本发明专利技术黑平菇提纯物的制备方法，简单容易操作，并且利用黑平菇菌丝为原材料，通过液体培养可获得大量菌丝，使成本大大降低。

Black mushroom extract, preparation method and application thereof

The invention discloses a black mushroom extract, a preparation method and application thereof. The method is: (1) the black mushroom mycelium powder and pH value of phosphate buffer mixture of 6 - 9, 2 - 6 DEG C in extraction, centrifugation supernatant obtained black mushroom extract solution; (2) by adding ammonium sulfate to saturation was 40%, in 2 - 6 DEG C place 8 to 16 hours after centrifugation; (3) by adding ammonium sulfate to saturation was 70%, in 0 - 4 DEG C place 8 to 16 hours after centrifugation. (4) TMV protein was obtained by dissolving and precipitating with distilled water. The invention belongs to a natural extract, and is harmless to human and environment. The invention relates to a preparation method of the black mushroom extract, which is simple and easy to operate, and can obtain a large number of hyphae by liquid culture, and the cost is greatly reduced.

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种黑平菇提取物及其制备方法与应用，特别涉及一种黑平菇抗植 物病毒的蛋白提取物及其制备方法与其在防治植物病毒病中的应用。
技术介绍
TMV)属于烟草花叶病毒属(7b6amoWrws C^o叩)，病毒为单链RNA，呈螺旋状。寄主范围广泛，可侵染番茄、辣椒、烟草等 多种植物，田间最显著的症状是花叶、叶片畸形和植株矮縮，田间发病率一般在 5%-20%，造成损失可达30%~50%，严重者绝收，是农业生产上的重要病害之一。生产中，已有多类化学源抗植物病毒农药在应用，但其效果并不十分理想，且 随着植物抗药性的增加和人们对生态环境的重视，化学源农药的发展受到了限制。 近几年，人们把抗植物病毒的研究重点聚焦在寻找环境友好型且抗病毒活性更高的 天然产物上。椐报道一些微生物中含有抑制植物病毒的活性物质，缺点是这些微生 物一般较为昂贵，大规模生产存在困难，且获得其活性物质的操作步骤较为繁琐， 不利于实际生产中的应用。平薛(/^/erotus ostrea加)，属担子菌亚门(5asWo/n7co朋)，侧耳属(尸Jerofus)。 其具有该属的主要形态特征，担子果单生或丛生，菌盖直径4-15cm，扇形，边缘内巻；菌 褶延生，可达10ram宽，中等密度，具小菌褶；菌柄侧生或稍偏生；菌丝系统为单系菌丝型， 所有菌丝具锁状联合。该菌分布广泛，易于大规模培养，且生长迅速、产量高。黑平菇是平菇的一个菌株，其子实体颜色为深黑色，色泽的深浅随温度的变化而有变 化，栽培简易，深层发酵生物量高，品质好。到目前为止，国内外尚未有关于黑平菇菌株 提取物抗植物病毒的任何报道。本专利技术首次以黑平菇为材料，对其菌丝粗提液进行了 生物活性分析，并对其抗病毒活性物质进行了提纯和性质研究，为抗TMV的生物源 农药开发提供了材料和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种黑平菇提取物及其制备方法与应用。 本专利技术所提供的黑平菇提取物的制备方法，是将黑平菇菌丝粉与pH值为7.0-9.0的磷酸缓冲液(PBS)混合，在2-6C浸提，离心后的上清液即为黑平菇的菌丝粗提液。所述方法中，黑平菇菌丝干粉的重量与磷酸缓冲液的混合比例为lg: 10-20ml。所述方法中，磷酸缓冲液的pH值为8.0;所述浸提的时间为l-3小时。所述方法中，黑平菇菌丝干粉为黑平菇菌丝接种于液体培养基上，于2rc-36t: 间培养3-8天后的菌丝干燥粉碎所得；所述液体培养基成分为18g/L马铃薯淀粉、 25g/L葡萄糖、30g/L玉米粉、25g/L豆浆粉、8g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、3g/L牛肉 膏、3g/LKH2P04、 lg/LK2HP04、 1.5g/LMgS04、 30mg/LVB!。所述方法中，菌丝培养的时间为3-8天，优选为5天。所述方法中，黑平燕菌丝粉的粒径为60目以下。所述方法中，黑平菇提取物溶液还经过下述步骤的提取1) 将所述黑平菇的菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，于2~6放置6~12 小时后，离心，收集上清液；2) 在通过步骤l)得到的上清液中加入硫酸铵至饱和度为70%，于2 6C放置 6~12小时后，离心，收集沉淀得到黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物。本专利技术所提供的黑平菇提取物为上述方法制备的黑平燕提取物。 本专利技术黑平菇提取物可用于防治烟草花叶病毒。具体方法为将上述黑平菇提取物用水稀释至总蛋白浓度为100-200ug/ml的黑平菇提取物溶液，喷施于长势一致的3-4叶期烟草上。本专利技术的黑平菇提取物对烟草花叶病毒具有很好的抑制效果，在提取物调至蛋白 浓度为200ug/ml喷施烟草72小时后，接种烟草花叶病毒，对烟草花叶病毒的抑制 率达到77.49%。本专利技术的黑平菇提取物属于天然提取物，对人类和环境均无害。本专利技术 黑平菇提取物的制备方法，简单容易操作，并且利用黑平菇菌丝为原材料，通过液体培养 可获得大量菌丝，成本较为低廉。 附图说明图1为本专利技术的黑平燕提取方法的流程示意图图2为黑平菇菌丝粉粗提液级黑平菇蛋白粗提物物抗烟草花叶病毒实验照片 具体实施例方式下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所示 的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例l、黑平菇提取物的提取方法及其TMV抑制实验 一、黑平菇的摇瓶培养条件的优化1、 菌种活化将-2(TC冷冻保存的黑平菇菌丝体，接种于PDA平板培养基上， 25C培养3天得到生长活力旺盛的黑平燕菌丝。2、 黑平菇的液体培养1) 一级菌种制备将步骤1得到的平板活化的菌丝切成小块儿，转入装有100ml 下述培养基的500ml摇瓶中，接种量为可为0.5-1.5g菌丝/L，本实施例采用lg/L,于 27°C、 220rpm摇培3天得到活化的菌丝，即一级菌种(浓度为30-40g/L)。上述一级菌种制备的培养基配方18g/L马铃薯淀粉、25g/L葡萄糖、30g/L玉 米粉、25g/L豆桨粉、8g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、3g/L牛肉膏、3g/LKH2P04、 lg/L K2HP04、 1.5g/LMgS04、 30mg/LVBj。2) 黑平燕菌丝体的液体培养将步骤1)得到的一级菌种培养液按照体积百分比浓度为8%的接种量接种到装 有100ml步骤l)所述的培养基的500ml摇瓶中，于27。C、 220rpm摇瓶培养。3、 不同液体培养天数黑平菇菌丝粗提液的获得接种摇瓶三天后开始取样，每隔24小时取I次，连续取六次，每次取2瓶，抽 滤收集菌丝，然后按照下述方法获得黑平菇菌丝粗提液1) 将上述获得的黑平菇菌丝于4(TC烘箱中烘干，粉碎，过60目筛得到黑平菇 菌丝粉末。2) 分别将2g通过步骤1 )得到的黑平菇菌丝干粉与0. 025mol/L p朋.0的PBS 按照lg/10ml的比例混合，于4°C，浸提2小时，10000rpm离心25min，收集上清液， 用0. 025mol/L pH8. 0的磷酸缓冲液定容至20ml，即为黑平菇菌丝粗提液。4、 不同培养天数对黑平菇菌丝粗提液总蛋白浓度的影响用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测步骤3得到的不同培养天数的黑平菇提取物粗提液的蛋白浓度，测定方法按照试剂盒的说明书进行。结果如表l所示，结果显示随着培养天数的增加，菌丝干粉粗提液总蛋白的浓度先增加后下降，在培养的八天中，第五天的总蛋白浓度较高，说明该时期蛋白表达处于一个较高水平。在后续试验中，我们选择第五天的菌丝作为提取物的材料。表1.不同培养天数的黑平菇菌丝缓冲液提取物总蛋白浓度<table>table see original document page 5</column></row><table>5、液体培养天数对黑平菇菌丝粗提液的抗烟草花叶病毒效果的影响1)植株处理将步骤3得到的发酵培养天数不同的黑平燕菌丝粗提液分别用水稀释得到总蛋白浓度为200u g/ml的溶液，分别对三至四叶期的枯斑三生烟 OV!.co朋a ta6a，5a脂/ 棚进行整株喷雾，每个处理三个重复，每个重复三株， 每株三片叶子。同时用清水喷施于三至四叶期的枯斑三生烟作为对照(CK)，设置三个重复，每个重复三株，每株三片叶子。2) 病毒接种液的制备病毒来源为本研究室保存的烟草花叶病本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黑平菇提取物的制备方法，是将黑平菇菌丝粉与ｐＨ值为７－９的磷酸缓冲液混合，在２－６℃浸提，离心取上清液得到黑平菇提取物溶液。

【技术特征摘要】
1、一种黑平菇提取物的制备方法，是将黑平菇菌丝粉与pH值为7—9的磷酸缓冲液混合，在2—6℃浸提，离心取上清液得到黑平菇提取物溶液。2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述黑平菇菌丝粉与所述磷酸缓 冲液的混合比例为lg黑平菇菌丝粉干重10—20ml磷酸缓冲液。3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述磷酸缓冲液的pH值为8.0; 所述浸提的时间为l一3小时。4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述黑平燕菌丝粉为黑平燕菌丝 接种于发酵培养基在21 — 36。C发酵培养3 — 10天得到的菌丝，干燥粉碎得到的；所 述发酵培养基为含18g/L马铃薯淀粉、25g/L葡萄糖、25g/L豆浆粉、8g/L蛋白胨、 5g/L酵母粉、3g/L牛肉膏、3g/LKH2P04、 lg/L K2HP04...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建华，李兴红，严红，朱琳，卢娜，周莹，黄金宝，林秀敏，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]