一种改进的植物线虫永久玻片制作方法，属于植物线虫标本制作技术领域。包括以下步骤：1）线虫的杀死与固定，用固定液热杀死且同时固定线虫；2）线虫的脱水：在线虫的脱水过程中采用梯度脱水法，在对线虫脱水过程的各环节中，均在体视显微镜下操作；3）线虫永久玻片的制作：在制片过程中，用载玻片包装盒中的薄型纸做支撑物、采用无色透明指甲油封片。上述一种改进的植物线虫永久玻片制作方法，其操作过程和所需材料比常规线虫永久玻片制片方法简化了许多，降低了制作难度，提高了制片质量和成功率，为制作植物线虫永久玻片标本提供了一种操作简便、低成本、高效率的新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物线虫标本制作
，具体为。
技术介绍
植物线虫属于无脊椎动物中的线虫门，是一类寄生于植物根、茎、叶、果实、种子等部位的线虫，其种类繁多、分布广泛、寄主多样、危害严重。据不完全统计 ，全世界每年因植物线虫造成的农林作物经济损失在数千亿元以上。近年来，随着国际间贸易往来的日益频繁，进出境种苗及其植物繁殖材料增多，各种植物病害尤其是线虫病害传播的机会大大增力口，使得植物线虫成为世界各国广泛关注的对象。在植物线虫研究工作中，永久玻片制作作为最经典实验技术之一，可将线虫标本长期保存下来，以便进一步线虫形态结构观察、各种数据的测量及分类鉴定，尤其对鉴定的新种模式标本更为重要。如果玻片效果不佳，则后续得到的结果可信度将大打折扣，因此制作好的植物线虫永久玻片是进行传统的以形态特征为基础的分类和鉴定研究的前提条件。目前，线虫永久玻片标本的制作程序较为复杂，具体步骤如下①杀死目标线虫需将目标线虫悬浮液内加沸水使温度为56-58°C以热杀死线虫。该法中目标线虫需是活的，最好是刚从土壤或植物组织中分离出的，若分离出的目标线虫放置过久而没有固定或固定时间短，会使线虫变形。②线虫的固定室温自然降温后，再加TAF固定液(福尔马林IOml+冰醋酸Iml+甘油2ml+蒸懼水87ml)以固定线虫形态。③线虫的脱水有乳酹油法、甘油-乙醇法和4 1FG固定液法3种方法较为常用。乳酚油法，即取一洁净凹玻片，在凹穴内加满乳酚油(苯酚20ml+乳酸20ml+甘油40ml+蒸馏水20ml);将凹玻片置于65_70°C电热板上预热；把固定Id以上的线虫挑至热的乳酚油中2-3min即可。该法在操作中涉及强毒性化学试剂苯酚，具一定的危险性，且标本置于光下易遭破坏。甘油-乙醇法，即将已固定的线虫挑入有0. 5-lml溶液I (95%乙醇20ml+甘油Iml+蒸馏水79ml)的小皿中；在干燥器内注入95%乙醇至器积的1/10左右，把上述小皿置于干燥器内并盖上干燥器盖；把干燥器放入35-40°C烘箱，12h后移出；打开干燥器盖，去掉小皿中大部分溶液后，用溶液II (甘油5ml+95%乙醇95ml)加至小皿满为止；将小皿放到一个大培养皿中，40°C烘箱12h，直至最后小皿中只剩下甘油为止。该法线虫脱水时主要依靠经验，易形成蒸发过快引起线虫扭曲变形。4 :1FG固定液法，即把固定线虫的小皿放入40°C烘箱内，盖子留有缝隙，让水分不断蒸发；视蒸发情况，及时补加同温下预热的该固定液，用量一般占小皿体积的2/3 ;通过不断的“蒸发一添加”，直到小皿中水分完全蒸发掉，只存留少量甘油为止。该法在操作中主要依靠经验，且耗时过长，约需5-6周。④制片用一直径为I. 5cm的干净打孔器在酒精灯火焰上加热，立即蘸取少量石蜡凡士林混合体(8份石蜡和3份凡士林在65°C下混匀即可)，并在一洁净载玻片中央轻按，待冷却后即为一蜡环；在蜡环内滴一小滴纯甘油；在体视显微镜下用挑针将已完全脱水的线虫移至载玻片上纯甘油滴的中央，用针均匀排列并将其沉下底；用挑针蘸3根与线虫粗细接近的玻璃纤维丝，呈三角形排列在线虫的边缘，以防标本干瘪或压扁虫体；取一洁净的盖玻片，在酒精灯火焰上轻烤数秒后盖于纯甘油滴上方；将此载玻片移至65-70°C加热板上加热，直至石蜡凡士林混合剂融化；将载玻片移至实验台冷却，再用中性树脂、阿拉伯胶等封片剂封片；待封片剂干燥后贴上标签即可。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术的目的在于设计提供的技术方案，其方法简便、环保、可操作性强。所述的，其 特征在于包括以下步骤 1)线虫的杀死与固定将分离的新鲜线虫挑入盛有适量水的小皿内，将盛有固定液的试管置于盛有沸水的烧杯中水浴为3-5min，在体视显微镜下用移液器小心吸出线虫小皿内的水层至皿底，取水浴中的固定液迅速加入小皿中，热杀死并固定线虫7-9天；所述的固定液由体积比的以下物质组成40%甲醛6-10%、纯甘油1_5%、蒸馏水85-93% ； 2)线虫的脱水在体视显微镜下用移液器小心移去固定液，在小皿内加适量脱水液I，并将其敞口置于盛有酒精的密闭保鲜盒中39-43°C过夜，在体视显微镜下小心吸去小M内的脱水液I，加入脱水液II，用盖玻片盖住小皿口，置于加有纯甘油的密闭保鲜盒中39-43°C下放置2-4h ;然后直接向小皿内加1-2滴纯甘油，加盖玻片继续封盖小皿，并将小皿置于加有纯甘油的密闭保鲜盒中39-43°C下过夜，去掉小皿上的盖玻片，将小皿再置于加有纯甘油的密闭保鲜盒中39-43°C下放置4-6h ;小皿开口移动至密闭的干燥器内，室温下放置1-1. 5周后，其中的线虫标本即可用于制作永久玻片； 所述的脱水液I由体积比的以下物质组成96%乙醇15-24%、纯甘油0. 5-2. 5%、蒸馏水75-84% ;所述的加入脱水液II由体积比的以下物质组成96%乙醇94-96%、纯甘油4-6% ； 3)线虫永久玻片的制作将一直径l_2cm的干净打孔器I端部在酒精灯火焰上加热为8-12s，趁热迅速插入到低熔点蜡盘中蘸取少量石蜡，在一干净载玻片中央轻按，即做成一蜡环；收集载玻片包装盒中的薄型纸，并用一直径略小于干净打孔器I的干净打孔器II打为圆形薄纸，根据标本目的线虫的大小，选择圆形薄纸张数，并用剪刀在其中心剪出一小的圆形孔后置于蜡环内部；在圆形孔内滴一小滴纯甘油；在体视显微镜下用挑针将已完全脱水的线虫移至上述纯甘油滴的中央，将其沉底且均匀排列；取一洁净的盖玻片，在酒精灯火焰上轻烤数秒后盖于蜡环上方；将此载玻片移至65-70°C加热板上加热，直至石蜡融化；将载玻片移至实验台冷却，再用无色透明指甲油封片，贴上标签即可。所述的，其特征在于步骤I)中水浴时间为 3. 5_4min0所述的，其特征在于步骤I)中所述的固定液中各物质的体积比为40%甲醛7-9%，优选7. 5-8% ;纯甘油2-4%，优选2. 5-3% ;蒸馏水87-92%，优选 89-91%。所述的，其特征在于步骤2)中加脱水液I后密闭保鲜盒中的温度为40-42°C ;加脱水液II后密闭保鲜盒中的温度为40-42°C，放置时间为2. 5-3h ;然后加有纯甘油的密闭保鲜盒中的温度为40-42°C ;去掉盖玻片后密闭保鲜盒中的40-42 °C，放置时间4. 5-5h。所述的，其特征在于步骤2)中所述的脱水液I中各物质的体积比为96%乙醇17-23%，优选19-22% ;纯甘油O. 8-2. 2%，优选1-1. 8% ;蒸馏水 78-82%，优选 80-81%。所述的，其特征在于步骤2)中所述的脱水液II中各物质的体积比为96%乙醇92-97%，优选93-95% ;纯甘油3_7%，优选4_6%。所述的，其特征在于步骤3)中干净打孔器I的加热时间为9-10s，加热板的加热温度为66-68°C。 所述的，其特征在于步骤3)中所述的薄型纸为内衬纸或包装纸。上述，其操作过程和所需材料比常规线虫永久玻片制片方法简化了许多，降低了制作难度，提高了制片质量和成功率，为制作植物线虫永久玻片标本提供了一种操作简便、低成本、高效率的新方法。本专利申请中，除了另有说明的外，其它的百分含量均为重量百分含量。具体实施例方式以下结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例I 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种改进的植物线虫永久玻片制作方法，其特征在于包括以下步骤 1)线虫的杀死与固定将分离的新鲜线虫挑入盛有适量水的小皿内，将盛有固定液的试管置于盛有沸水的烧杯中水浴为3-5min，在体视显微镜下用移液器小心吸出线虫小皿内的水层至皿底，取水浴中的固定液迅速加入小皿中，热杀死并固定线虫7-9天；所述的固定液由体积比的以下物质组成40%甲醛6-10%、纯甘油1_5%、蒸馏水85-93% ； 2)线虫的脱水在体视显微镜下用移液器小心移去固定液，在小皿内加适量脱水液I，并将其敞口置于盛有酒精的密闭保鲜盒中39-43°C过夜，在体视显微镜下小心吸去小M内的脱水液I，加入脱水液II，用盖玻片盖住小皿口，置于加有纯甘油的密闭保鲜盒中39-43°C下放置2-4h;然后直接向小皿内加1-2滴纯甘油，加盖玻片继续封盖小皿，并将小皿置于加有纯甘油的密闭保鲜盒中39-43°C下过夜，去掉小皿上的盖玻片，将小皿再置于加有纯甘油的密闭保鲜盒中39-43°C下放置4-6h ;小皿开口移动至密闭的干燥器内，室温下放置1-1. 5周后，其中的线虫标本即可用于制作永久玻片； 所述的脱水液I由体积比的以下物质组成96%乙醇15-24%、纯甘油0. 5-2. 5%、蒸馏水75-84% ;所述的加入脱水液II由体积比的以下物质组成96%乙醇94-96%、纯甘油4-6% ； 3)线虫永久玻片的制作将一直径l_2cm的干净打孔器I端部在酒精灯火焰上加热为8-12s，趁热迅速插入到低熔点蜡盘中蘸取少量石蜡，在一干净载玻片中央轻按，即做成一蜡环；收集载玻片包装盒中的薄型纸，并用一直径略小于干净打孔器I的干净打孔器II打为圆形薄纸，根据标本目的线虫的大小，选择圆形薄纸张数，并用剪刀在其中心剪出一小的圆形孔后置于蜡环内部；在圆形孔内滴一小滴纯甘油；在体视显微镜下用挑针将已完全脱水的线虫移...
【专利技术属性】
技术研发人员：李戌清，郑积荣，李红斌，
申请(专利权)人：杭州市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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