一种梨种质抗黑斑病鉴定的方法技术

本发明专利技术公开了一种梨种质抗黑斑病鉴定的方法，它包括以下步骤：（1）梨黑斑病病原菌准备，主要为培养基配制、梨黑斑病分离鉴定、梨黑斑病原菌转接和梨黑斑病原菌活化及扩大培养；（2）梨抗黑斑病材料准备，主要为梨品种嫁接和梨嫁接品种移栽（3）人工接种鉴定，主要利用梨黑斑病病原菌孢子悬浮液对一年生梨品种嫁接苗叶片进行喷雾接种；（4）病情调查与分级标准。方法易行，操作简便，使用该方法能够本方法能够快速准确的对梨品种进行抗黑斑病鉴定。通过本发明专利技术处理可以有效解决梨科研、育种及生产中梨品种抗黑斑病快速鉴定的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于果树
，更具体涉及ー种梨种质抗黒斑病鉴定的方法，经该方法处理可以有效解决梨科研、育种及生产中梨品种抗黒斑病快速鉴定的问题。该方法适用于从事梨科研、育种及生产的科研単位、公司和个人。
技术介绍
梨属于蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科(Maloideae)梨属(Pyrus)植物，为乔本落叶果树，是我国三大栽培果树之一，在世界上亦占有举足轻重的地位。据中国年鉴统计，2010年我国梨种植面积1063. I千公顷，产量1505. 71万吨，居世界首位。梨果生产一直是我国农民增收致富的重要支柱产业，也是我国出口创汇的主要农产品之一。但随着砂梨栽培面积的扩大，梨黒斑病(Alternaria alternata(Fr. )Keissler)逐渐发展成为我国梨园中主要的病害，特别是在南方砂梨产区发病更为严重。梨黒斑病主要危害叶、果实和新梢，导致树体衰弱，缩短结果年限，造成严重的经济损失，而且还造成贮藏期病果，并在梨的进出口贸易中受到进ロ国的严密关注。梨黒斑病防治不当会造成梨树叶片提前脱落，容易使梨树形成二次花，严重影响次年梨果产量，一般梨黒斑病造成果农的损失可达20% -30%，严重时达到50% -60%。在我国南方梨产区，防治病害成功的关键主要是看梨园中梨黒斑病防治的效果，梨农一年中梨树一半以上的农药防治成本用于防治梨黒斑病。目前防治梨黒斑病的方法是使用甲基托布津、代森锰锌和苯醚甲环唑等化学药剂，长期使用这些化学药剂，如果使用不当必然会引起病原菌对化学药剂产生抗药性、污染环境和对人体健康产生危害等问题。为了克服化学药剂防腐的毒性缺点，制定合理有效梨黑斑病的综合防治措施，选育抗病性生产品种势在必行，但如何快速准确的鉴定梨品种在大面积推广过程中具有抗黑斑病的特性，已是摆在科研人员面前必须解决的重大课题。多年来，我们依托国家果树种质资源圃，围绕着梨种质抗黒斑病鉴定评价开展了大量科学研究与试验，总结专利技术出ー套梨种质抗黒斑病鉴定的方法。本方法是利用梨黒斑病病原菌孢子悬浮液对一年生梨品种嫁接苗叶片进行喷雾接种，接种后24小时内保持空气湿度在95%以上，接种后20天进行调查，根据病情级数计算病情指数，对梨种质进行抗黒斑病鉴定评价，采用本方法能够快速准确的对梨品种进行抗黒斑病鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了ー种梨种质抗黒斑病鉴定的方法，方法易行，操作简便，使用该方法能够本方法能够快速准确的对梨品种进行抗黒斑病鉴定。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施本专利技术是利用梨黒斑病病原菌孢子悬浮液对一年生梨品种嫁接苗叶片进行喷雾接种，接种后24小时内保持空气湿度在95%以上，接种后20天进行调查，根据病情级数计算病情指数，对梨种质进行抗黒斑病鉴定评价。ー种梨种质抗黒斑病鉴定的方法，其步骤是I.黑斑病原菌的准备(I)培养基的制备马铃薯培养基(PSA):马铃薯(去皮)200g，琼脂粉20g，蔗糖20g，水1000mL。配制方法如下将马铃薯去皮，切成约2cm2的小块，煮沸0. 5h，注意用玻璃棒搅拌以防糊。然后用双层纱布过滤，取其虑液加入琼脂粉，溶解后加入蔗糖，再补足水至1000mL，PH 7.0。(2)梨黒斑病分离鉴定采集的带有梨黒斑病病症的叶片或果实，參照2005年杜连祥，路福平主编的《微生物学实验技木》进行组织分离、单孢纯化、培养、保存。将分离获得的菌株接种到幼嫩的梨叶片上，观察能否产生典型的黒斑病病斑，然后再对病斑进行分离纯化。将分离纯化的 病原菌株在PSA培养基上划线培养6-8d，观察菌落形态；继续培养19-21天后在显微镜下观察病原菌的菌丝和孢子形态特征，參照1979年魏景超主编的《真菌形态学鉴定手册》，鉴定分离所得病原菌的种类。为了进一步确认梨黒斑病病原菌菌株的种名，采用rDNA-ITS分子鉴定法对分离的菌株进行分析。以病原真菌的DNA作为模板，用通用引物ITSl TCCGTAGGTGAACCTGCGG(序列 5_3’ )和 ITS4 :TCCTCCGCTTAITGATATGC(序列 5_3’)引物序列来源文献“ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用进行扩增”(2007年陈剑山，郑服丛)，将所测得的rDNA-ITS序列在GenBank中用Clustalx 2. 0. 10对分离梨黑斑病菌和已登录发表的梨黒斑病病原菌rDNA-ITS序列进行多重序列比对分析。综合病原菌形态学特征及rDNA-ITS序列测定比对结果，鉴定梨黒斑病菌。(3)梨黒斑病原菌转接将分离、纯化并鉴定的黒斑病原菌在新鲜的斜面PSA培养基上划线，光照培养箱28°C培养19-21天，长出孢子后放于冰箱4°C保存。(4)梨黒斑病原菌活化及扩大培养将保存的黒斑病原菌从冰箱中取出，用接种环在培养皿中划线，并在光照培养箱28で培养。等菌丝铺满培养皿后，在无菌条件下用菌丝块接种的方法在培养皿中扩大培养黒斑病原菌孢子。如此反复培养2-3次，培养出2 X IO5个孢子/mL的孢子悬浮液接种梨叶片。2、梨抗病性材料准备(I)梨品种嫁接10-11月间，当梨处于休眠期时，采集已选梨品种的枝条，采用芽接方法參照2010年胡红菊，王友平主编的《砂梨优良品种及标准化栽培技木》中苗木培育，在豆梨砧木上嫁接，每个品种嫁接50株。 (2)梨嫁接品种移栽1-2月间，在雨雪天气来临之前，将梨嫁接品种苗木移栽到简易的温室大棚中防止品种芽冻伤，温度控制在10-15度。3.人工接种鉴定(I)病原孢子液配制将培养皿扩大培养19-21天后，每个培养皿中加入20mL无菌水，用2cm型号牌刷将梨黒斑病孢子刷下，集中到IL的烧杯中，使用血球计数板在显微镜下计数，并用蒸馏水将梨黒斑病孢子稀释成浓度为2 X IO5个孢子/mL的孢子悬浮液，放入28°C培养中恒温下培养6h，发芽率在80%以上，待用。(2)人工接种待接种的梨品种整个生育期中不喷施杀菌剂，在6月-7月间将待接种梨品种顶芽去掉，使用2X105个孢子/mL的梨黒斑病孢子悬浮液喷雾接种到待鉴定嫁接梨品种上，喷雾至叶片正反面全部淋湿。接种后24小时内保持空气湿度在95%以上，接种后20天进行调查，根据病情级数计算病情指数，对梨种质进行抗黒斑病鉴定评价。4.病情调查与分级标准接种20天，调查接种梨品种全部叶片受害级别。同时调查鉴定品种的自然发病的病情指数，按每株东、西、南、北四个方向调查，每个方向随即调查50片叶。病情调查与分级标准0级无病斑；I级病斑占叶面积的10%以下；3级病斑占叶面积的10% 25% ;5级病斑占叶面积的26 % 40 % ;7级病斑占叶面积的41% 65% ;9级病斑占叶面积的65%以上。根据受害级别，计算黒斑病病情指数。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ー种梨种质抗黒斑病鉴定的方法，其步骤是 A、黒斑病原菌的准备 首先是培养基的选择，选择马铃薯培养基，制备方法为马铃薯200g，琼脂粉20g，蔗糖20g，水1000M1，配制方法如下将马铃薯去皮，切成2cm2的小块，煮沸0. 5h，用玻璃棒搅拌，然后用双层纱布过滤，取其虑液加入琼脂粉，溶解后加入蔗糖，再补足水至1000mL，PH 7.0 ；其次是梨黒斑病分离鉴定步骤，鉴定方法为采集的带有梨黒斑病病症的叶片或果实，按常规方法进行组织分离、单孢纯化、培养、保存，将分离获得的菌株接种到幼嫩的梨叶片上，观察黒斑病病斑，对病斑进行分离纯化，将分离纯化的病原菌株在PSA培养基上划线培养6-8d，观察菌落形态；继续培养19-21天后在显微镜下观察病原菌的菌丝和孢子形态特征，參照真菌形态学鉴定手册，鉴定分离所得病原菌的种类，为了确认梨黒斑病病原菌菌株的种名，采用rDNA-ITS分子鉴定法对分离菌株进行分析，以病原真菌的DNA作为模板，用通用引物ITSl和ITS4进行扩增，将所测得的rDNA-ITS序列在GenBank中用Clustalx 2. 0. 10对分离梨黒斑病菌和已登录发表的梨黒斑病病原菌rDNA-ITS序列进行多重序列比对分祈，综合病原菌形态学特征及rDNA-ITS序列測定比对結果，鉴定梨黒斑病菌；再次是梨黑斑病原菌转接，转接步骤为将分离、纯化并鉴定的黒斑病原菌在新鮮的斜面PSA培养基上划线，光照培养箱28°C培养19-21天，长出孢子后放于冰箱4°C保存；最后为梨黑斑病原菌活化及扩大培养，培养方法为将保存的黒斑病原菌从冰箱中取出，用接种环在培养皿中划线，并在光照培养箱28 V培养，菌丝铺满培养皿后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡红菊，杨晓平，陈启亮，田瑞，张靖国，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院果树茶叶研究所，
类型：发明
国别省市：